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尖尾芋醇提物保护黑色素瘤小鼠脾的作用机制

2022-02-12 117 上传者：管理员

摘要：目的研究尖尾芋醇提物对荷瘤小鼠脾保护的作用机制。方法C57BL/6小鼠背部右侧皮下接种黑色素瘤B16-F10细胞后,将未造模的6只小鼠作为正常组（normal）,造模的30只小鼠随机分为模型组（model）、环磷酰胺组（CTX）和低、中、高剂量的尖尾芋醇提物组（lEAC、mEAC、hEAC）,每组各6只。连续给药10d,末次给药24h后,小鼠眼球采血后颈椎脱臼处死,剥离脾组织并称重计算脏器指数,以苏木精-伊红（HE）染色观察脾组织的病理变化,以TUNEL荧光染色检测不同组小鼠脾组织中细胞凋亡的情况,以免疫组化检测脾组织中B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）和胱天蛋白酶-3（caspase-3）蛋白表达水平,以细胞计数法-8（CCK-8）法检测尖尾芋醇提物对正常小鼠脾细胞的生长活性的影响。结果模型组和高剂量尖尾芋醇提物组脾指数分别为5.26±0.94和7.78±1.63,差异有统计学意义（P<0.01）。免疫组化中,正常组、模型组和高剂量尖尾芋醇提物组小鼠脾组织中Bcl-2阳性细胞IOD值分别为8171.34±1210.74,712.79±203.90和7437.72±1342.33;Bax阳性细胞IOD值分别为1235.50±302.81,1.14×104±882.91和5241.06±991.12;caspase-3阳性细胞IOD值分别为2197.56±388.14,1.08×104±700.90和3267.04±531.23。模型组与正常组相比,高剂量尖尾芋醇提物组与模型组相比,差异均有统计学意义（均P<0.01）。结论尖尾芋醇提物能够抑制荷瘤小鼠的脾组织在肿瘤微环境下发生异常凋亡,对荷瘤小鼠脾组织具有一定的保护作用,其作用机制与上调Bcl-2抗凋亡的蛋白的活性,降低Bax促凋亡的蛋白的活性,减低caspase-3蛋白表达相关。

关键词：
B细胞淋巴瘤2相关-X蛋白
B细胞淋巴瘤2蛋白
尖尾芋醇提物
胱天蛋白酶3
脾保护
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恶性肿瘤的发生、发展都伴随有机体免疫功能的降低，而中医药在肿瘤的治疗中具有独特优势。中医药对于肿瘤治疗以辩证论治为基本原则，强调以人为本、因人施治，有固本清源、扶正祛邪、以毒攻毒等治法。如在扶正方面更注重于机体的整体观和平衡观，着力于提高机体的免疫力来对抗肿瘤。脾是重要的免疫器官，脾中具有多种免疫细胞和免疫因子，这些细胞及因子能通过T细胞、B细胞介导的细胞免疫和体液免疫发挥特异性免疫功能，也可以用过吞噬作用完成非特异性免疫功能[1,2]。本课题组前期研究结果表明，抗癌中药尖尾芋的醇提取物在体内体外都具有较强的抗肿瘤活性，能够直接杀伤肿瘤细胞，提高血清中-免疫相关因子水平，抑制肿瘤细胞在小鼠体内的生长[3,4]。为了进一步明确中药尖尾芋抗肿瘤作用的免疫相关机制，揭示其与荷瘤机体免疫功能之间可能存在的关系，本实验通过探讨尖尾芋醇提物对荷瘤小鼠免疫功能的影响来阐释其可能的作用机制。

一、材料与方法

1、材料

动物C57BL/6小鼠，体质量14～18g，雄性，鼠龄6～7周，购自南方医科大学实验动物中心。动物生产许可证:SCXK(粤)2016-0041;动物使用许可证号:SYXK(粤)2016-0167。本实验经南方医科大学动物伦理委员会批准。

药品与试剂尖尾芋采自广西桂林地区，经南方医科大学中医药学院药用植物鉴定教研室马骥教授鉴定为天南星科(Araceae)海芋属植物尖尾芋(Alocasiacucullate(Lour.)Schott)的根茎。注射用环磷酰胺，规格:每支0.5g，批号:70370，批准文号:国药准字H32026196，江苏恒瑞医药股份有限公司生产。原位末端标记法(TUNEL)细胞凋亡检测试剂盒，德国Roche公司生产;二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒，购自美国DAKO公司;B细胞淋巴瘤2(Bcl-2),B细胞淋巴瘤2相关X蛋白(Bax)，胱天蛋白酶3(caspase-3)抗体，均购自美国CellSignalingTechnology公司;红细胞裂解液裂，购自上海碧云天生物科技有限公司;细胞计数试剂盒-8(CCK-8)试剂盒，购自日本同仁公司。

仪器GT1001免疫组化笔，美国GeneTech公司产品;IX53荧光倒置显微镜，日本Olympus公司产品。

2、实验方法

2.1 尖尾芋醇提物的制备

参照文献[5]方法制备尖尾芋醇提物。简述如下:取晒干的尖尾芋根茎，粉碎，过筛。精密称取尖尾芋粉末，加入8倍体积的50%乙醇浸泡0.5h后，回流提取1.5h，冷却过滤，收集第1次过滤后的醇提液;将过滤后的滤渣中加入6倍体积50%乙醇回流1.5h后过滤，收集第2次过滤后的醇提液;再将过滤后的滤渣中加6倍体积50%乙醇回流1.5h后过滤，收集第3次过滤后的醇提液。然后将3次醇提液混合，浓缩至干浸膏，得到尖尾芋醇提物，放4℃冰箱保存，备用。

2.2 黑色素瘤动物模型的建立及给药干预

2.2.1 构建瘤株

取对数期生长的小鼠黑色素瘤B16-F10细胞，经胰蛋白酶消化后用完全培养基终止消化，再用1mL移液器轻轻吹打制成单细胞混悬液，以800r·min-1离心5min后弃去上清液，再用无菌生理盐水调整细胞密度至1×107/mL，备用。

2.2.2 接种肿瘤[6]

将密度为1×107/mL细胞按每只0.2mL(5×106个细胞)小鼠接种小鼠背部右侧皮下。小鼠接种第6天，可观察到每只小鼠背部接种肿瘤的部位有微微的凸起，表明小鼠肿瘤接种成功。

2.2.3 动物分组及给药

将未造模的6只小鼠作为正常组(Normal)，造模的30只小鼠随机分为模型组(Model)、环磷酰胺组(CTX)和低、中、高剂量尖尾芋醇提物组(lEAC、mEAC、hEAC)，每组各6只。造模后第6天，正常组及模型组小鼠灌胃等量的生理盐水;CTX组按0.05g·kg-1·d-1腹腔注射环磷酰胺，隔日给药1次;低、中、高剂量尖尾芋醇提物组小鼠分别灌胃给予0.5,2,8g·kg-1·d-1的尖尾芋醇提物，每天1次，连续10d。

2.3 免疫器官指数的计算[7]

给药10d后各组小鼠眼球采血后处死，解剖，用手术镊小心取出脾和胸腺器官，称重。按照如下公式计算脾及胸腺指数:脾指数=脾重量(mg)/小鼠体质量(g);胸腺指数=胸腺重量(mg)/小鼠体质量(g)。

2.4 以苏木精-伊红(HE)染色观察脾组织形态的改变[8]

将经4%多聚甲醛固定的脾组织经乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡渗透、石蜡包埋后，切成厚度为4μm的石蜡切片。经HE染色后，分别在×200和×400的光镜下观察小鼠脾的病理变化。

2.5 以TUNEL荧光染色检测脾组织的凋亡情况[9]

将脾组织的石蜡切片放入二甲苯和乙醇中进行脱蜡，经蒸馏水水化、蛋白酶K修复、破膜液破膜后，滴加TdT-dUTP=2∶29比例的混合液，然后使用DAPI复染细胞核后，用抗荧光淬灭封片剂进行封片，置于倒置荧光显微镜下观察并采集图像。

2.6 以免疫组化法检测脾组织中Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白的表达情况[10]

将脾组织的石蜡切片进行脱蜡和水化处理后。切片用枸橼酸抗原修复缓冲液进行抗原修复，后加入3%的过氧化氢溶液除去内源性过氧化氢酶，再滴加3%的BSA进行封闭，一抗孵育后置于4℃冰箱孵育过夜。二抗室温孵育50min后，加入DAB显色，最后用苏木精复染后进行脱水封片。

2.7 以CCK-8法检测尖尾芋醇提物对正常小鼠脾细胞活性的影响[11]

用颈椎脱臼法处死C57BL/6小鼠，消毒体表后，用无菌手术镊小心取出小鼠脾，碾碎脾组织后过200目筛得到细胞悬液。将细胞悬液离心后，加入红细胞裂解液，离心后，弃上清液，收集未贴壁的细胞即为脾淋巴细胞，调整细胞浓度为2×106cell·mL-1。96孔板中每孔加入脾淋巴细胞悬液100μL后，给药组分别加入5,10,20,40,80μg·mL-1的尖尾芋醇提物，每组设6个复孔。空白对照为不含药物的RPMI-1640完全培养基，分别给药后放置于恒温细胞培养箱培养48h。细胞培养结束后，每孔加入CCK-8试剂10μL，置于恒温细胞培养箱中继续培养4h，在450nm波长下测量每孔光密度(OD)值。

3、统计学处理

用SPSS20.0软件进行统计分析。数据用表示，组间比较用单因素方差(One-wayANOVA)分析，首先进行方差齐性检验，方差齐时选用LSDt检验，方差不齐时用Dunnett’sT3检验。

二、结果

1、尖尾芋醇提物对荷瘤小鼠免疫器官指数的影响

模型组和低、中、高剂量尖尾芋醇提物组的脾指数分别为5.26±0.94,5.92±1.27,7.36±1.83和7.78±1.63。与模型组相比，高剂量尖尾芋醇提物组能显著提高荷瘤小鼠的脾指数，差异有统计学意义(P<0.01)。

模型组和低、中、高剂量尖尾芋醇提物组的胸腺指数分别2.08±0.32,2.09±0.49,2.14±0.39和2.20±0.43。低、中、高剂量尖尾芋醇提物组与模型组相比，差异均无统计学意义(均P>0.05)。

2、脾组织HE染色

小鼠脾组织HE染色结果表明:正常组小鼠的脾结构清晰，由完整的红髓和白髓组成，且白髓与红髓之间的分界明显，红髓中可见少量巨噬细胞和树突状细胞;白髓中散在分布多量体积较小，生发中心不明显的圆形淋巴小结，多为初级淋巴小结(图1A)。模型组中小鼠脾织结构被破坏，白色和红色的浆细胞和淋巴细胞的密度明显降低(图1B)。与模型组相比，环磷酰胺组小鼠脾组织结构受损更严重，白色和红色的浆细胞和淋巴细胞的密度稀疏，细胞排列不规则(图1C)，而尖尾芋醇提物在一定程度上改善了小鼠脾的损伤程度，为维持使脾细胞的增殖提供了更为稳定的生长环境(图1D-F)。

3、尖尾芋醇提物对脾组织凋亡情况的影响

正常组小鼠脾组织表现出荧光信号强度弱，说明在正常情况下脾组织未发生异常的凋亡现象。与正常组相比，荷瘤小鼠脾中均出现了不同强度的荧光信号，说明在肿瘤微环境下，小鼠的脾组织均受到一定程度的损害，其中环磷酰胺组小鼠脾组织显示非常强的荧光信号，其次是对照组、低剂量尖尾芋醇提物组、中剂量尖尾芋醇提物组、高剂量尖尾芋醇提物组。与脾组织HE染色结果相一致，这些结果提示尖尾芋醇提物的治疗能够改善肿瘤进展过程中引起免疫器官损害的现象。

4、免疫组化检测脾组织中Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表达

与正常组相比，模型组小鼠脾组织中Bcl-2阳性细胞IOD值明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组相比，中、高剂量尖尾芋醇提物组小鼠脾组织中Bcl-2阳性细胞的IOD值均明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。与正常组相比，模型组小鼠脾组织中Bax、caspase-3阳性细胞IOD值均明显增加，差异均有统计学意义(均P<0.01);与模型组相比，低、中、高剂量尖尾芋醇提物组均能明显降低小鼠脾组织中Bax、caspase-3阳性细胞IOD值，差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)，见表1。

5、尖尾芋醇提物促进正常小鼠脾细胞的生长活性

小鼠脾细胞在不同浓度的尖尾芋醇提物(5,10,20,40,80μg·mL-1)作用下，OD值随给药浓度增加而增加，呈剂量依赖性上升。与空白对照组相比，尖尾芋醇提物能明显提高小鼠脾细胞的OD值，促进脾细胞的增殖，见表2。结果表明，尖尾芋醇提物能显著刺激体外正常小鼠脾细胞增殖。

三、讨论

有研究表明，许多肿瘤患者的免疫系统常常处于抑制状态，免疫活性细胞和活性因子功能低下，使肿瘤细胞更易于生长和转移[12]。本研究中，高剂量尖尾芋醇提物组相较于模型组具有较高的脾指数，提示尖尾芋醇提物组能提高荷瘤小鼠的免疫功能。现代研究表明，尖尾芋具有醇提物等活性成分，可通过提高机体免疫细胞的活力等发挥抗肿瘤作用[13]。而在本实验中，HE染色与TUNEL荧光染色结果均表明:荷瘤小鼠的脾组织均出现不同程度的损伤，而尖尾芋醇提物组中小鼠脾组织较模型组相比得到一定程度的改善，这表明中药尖尾芋提取物可以通过保护脾而提高机体免疫能力。

Bcl-2基因家族中促、抗凋亡成员之间的相互作用被认为是调节细胞凋亡的主要机制之一[14]。其中Bax是促凋亡蛋白，可释放凋亡蛋白，促进细胞凋亡，两者均存在于线粒体的外膜，Bcl-2是抗凋亡蛋白，能保护细胞免受凋亡，提高细胞存活率[15]。Bax能够与Bcl-2一起形成氨基二聚体，阻断Bcl-2抗凋亡的活性，降低Bcl-2蛋白对凋亡的抑制作用，最终导致Bcl-2蛋白失活，同时Bax本身也可以形成同源二聚体能够直接促进细胞的凋亡[16]。Bax和Bcl-2不但可作为caspase-3的上游调控机制，还可以作为caspase-3的直接底物，两者既联系又制约。Caspase-3作为caspase家族中最重要的凋亡因子之一，处于凋亡反应的下游，是多种凋亡信号的聚焦点，它的活化标志着细胞凋亡进入不可逆阶段，在细胞凋亡过程中具有重要的生物学意义[17]。本研究免疫组化法结果表明，尖尾芋醇提物可不同程度地升高荷瘤小鼠脾组织中Bcl-2蛋白表达水平，降低Bax和caspase-3蛋白表达水平，抑制免疫细胞凋亡。此外，CCK-8结果表明，尖尾芋醇提物能促进正常小鼠脾淋巴细胞的活性，提示尖尾芋醇提物具有免疫调节作用。

尖尾芋醇提物能够抑制荷瘤小鼠的脾组织在肿瘤微环境下发生异常凋亡，对荷瘤小鼠脾组织具有一定的保护作用，其作用机制与上调Bcl-2抗凋亡的蛋白的活性，降低Bax促凋亡的蛋白的活性，减低caspase-3表达相关。

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文章来源：肖市林,房淼,林汝堃,周绮纯,陈毅飞,李婵,罗超华,莫志贤.尖尾芋醇提物保护黑色素瘤小鼠脾的作用机制[J].中国临床药理学杂志,2022,38(03):228-232.