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氯喹联合顺铂对结肠癌HCT116细胞的增殖和凋亡的影响

2022-02-12 336 上传者：管理员

摘要：目的探讨氯喹（CQ）联合顺铂（DDP）对人结肠癌HCT116细胞增殖和凋亡的影响及其可能机制。方法将HCT116细胞分组为16组:空白对照组（不加药物）、5个浓度(5,10,20,40,80μmol•L-1)氯喹-1组至氯喹-5组,5个浓度(2,4,8,16,32μmol•L-1)顺铂-1组至顺铂-5组和5个浓度(20μmol•L-1氯喹+2,4,8,16,32μmol•L-1顺铂)联合-1组至联合-5组,各组均培养24h。用噻唑蓝法检测细胞的存活率,用PI单染流式细胞术检测细胞的凋亡情况,用蛋白质印迹法检测B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）等凋亡相关蛋白的表达水平（灰度值）。结果空白对照组、氯喹-1组至氯喹-5组、顺铂-1组至顺铂-5组和联合-1组至联合-5组于24h的细胞存活率分别为（100.00±1.05）%,（99.65±1.98）%,（97.43±0.72）%,（83.88±0.51）%,（69.65±3.33）%,（51.87±0.49）%,（98.55±1.50）%,（92.33±0.50）%,（81.66±4.29）%,（70.41±0.50）%,（48.34±1.50）%,（78.61±4.37）%,（59.01±3.52）%,（37.23±0.57）%,（32.88±3.96）%和（21.09±2.57）%。空白对照组、氯喹-3组、顺铂-3组和联合-3组的细胞凋亡率分别为（1.63%±0.50%）,（15.97%±1.40%）,（24.83%±2.12%）和（47.23±4.29）%;这4组的Bcl-2相对表达量分别为1.11±0.01,0.92±0.03和0.73±0.08,0.46±0.07;这4组的Bax蛋白相对表达量分别为0.18±0.01,0.27±0.03,0.46±0.09和0.58±0.04。氯喹联合顺铂能显著减少抗凋亡Bcl-2蛋白的表达,并上调促凋亡Bax蛋白的表达。联合组与单用组比较,上述指标的差异均有统计学意义（均P<0.05）;各给药组与空白对照组比较,上述指标的差异均有统计学意义（均P<0.05）。结论氯喹可以增强顺铂对HCT116细胞的增殖抑制作用,同时可以增强顺铂诱导结肠癌细胞的凋亡,其机制可能与下调Bcl-2和上调Bax有关联。

关键词：
增殖抑制
氯喹
细胞凋亡
结肠癌
顺铂
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结直肠癌是常见的消化道肿瘤之一，世界卫生组织国际癌症研究中心(IARC)资料显示，2012年全世界约有136万结直肠癌新发病例，居恶性肿瘤第3位，位于肺癌、乳腺癌之后;死亡约69万例，位于肺癌、肝癌和胃癌之后，居恶性肿瘤第4位[1]。顺铂(DDP)在治疗中易引发耐药而致预后较差，同时其毒性反应所致低耐受性也限制了它的临床应用[2]。氯喹(CQ)是一种特异性自噬抑制药，通过其弱化溶酶体酸性环境的功效，使溶酶体的酶活性丧失从而达到抑制自噬的作用[3]。在近年的临床研究中，氯喹对结肠癌、胃癌和肺癌等多种肿瘤均有抑制作用，并能促进多种抗癌药物对肿瘤细胞的杀伤作用，因此作为一种潜在的抗癌剂和化学增敏剂而备受重视。本实验用不同剂量的CQ和/或DDP处理细胞，检测其对人结肠癌HCT116细胞增殖能力、凋亡等细胞生物学的影响及其可能的作用机制。

一、材料与方法

1、材料

细胞人结肠癌HCT116细胞，购自中国科学院上海细胞库。

药品与试剂氯喹，规格:每支25mg,CAS:54-05-7，批号:C6635，美国Sigma公司生产;顺铂，规格:每支20mg/20mL，批准文号:国药准字H20030675，批号:20181004，南京制药厂有限公司生产。RP1640培养基、胰蛋白酶、胎牛血清，均购自美国Hyclone公司;兔抗人B细胞淋巴瘤-2(B-celllymphoma-2,Bcl-2)单抗体、兔抗人Bcl-2相关X蛋白(Bax)抗体及β-肌动蛋白(β-actin)抗体，均由美国SantaCruz公司生产。

仪器Epoch多功能酶标仪，美国BioTek产品;CKX53倒置显微镜，日本Olympus公司产品;MiniProtean电泳仪，美国Bio-Rad公司产品。

2、实验方法

2.1 细胞培养[4]

结肠癌HCT116细胞培养用RP1640培养液，含10%胎牛血清、3.7g·L-1碳酸氢钠、1.0×105U·L-1青霉素和100mg·L-1链霉素，在37℃的饱和湿度、体积分数5%的CO2培养箱中常规传代培养。

2.2 细胞分组与处置

将HCT116细胞分组为16组:空白对照组(不加药物)、5个浓度(5,10,20,40,80μmol·L-1)氯喹-1组至氯喹-5组，5个浓度(2,4,8,16,32μmol·L-1)顺铂-1组至顺铂-5组和5个浓度(20μmol·L-1氯喹+2,4,8,16,32μmol·L-1顺铂)联合-1组至联合-5组，各组均培养24h。

2.3 以噻唑蓝(MTT)法测定细胞存活率[5]

用0.25%胰蛋白酶消化制备单细胞悬液，按每孔7×103个细胞接种于96孔板，每个组设5复孔。分组与处置同“2.2”，孵育24,48,72h后，每孔各加入MTT溶液15μL并培养4h，弃上清液，再加入二甲基亚砜(DMSO)150μL，于37℃下孵育30min，在酶标仪中振荡10min，用酶标仪于570nm处检测各组光密度(OD)值。细胞存活率(%)=(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100%。实验重复3次。

2.4 以DAPI染色法测细胞核变化[6]

将分组处置的HCT116细胞接种于12孔板，每孔2×105个细胞，培养24h后，分别加入氯喹20μmol·L-1、顺铂8μmol·L-1及同浓度联合组处理细胞，继续孵育24h后，用磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤1次;4%多聚甲醛固定细胞15min，弃上清液，再用PBS洗涤3次，每孔加入DAPI染色液500μL，避光反应15min后，通过倒置荧光显微镜观察记录各组HCT116细胞核形态变化情况。

2.5 以PI单染检测结肠癌细胞凋亡情况[4]

前处理同“2.4”。给药后，以2000r·min-1离心10min，弃上清液。用PBS洗涤，再次离心，去上清液，各组加入冷藏的75%乙醇固定1mL,4℃保存。次日再次离心，去上清液。各组加PBS3mL复悬，再次离心后去上清液。各组加入PI染液600μL染色，室温下避光反应30min，用流式细胞仪检测HCT116细胞凋亡情况，具有亚G1期DNA含量的细胞比例，代表凋亡细胞数。实验重复3次。

2.6 以蛋白质印迹法检定凋亡相关蛋白(Bcl-2和Bax蛋白)的表达

分组与处置同“2.2”。用总体积胞裂解液200mL冰上裂解30min。提细胞总蛋白，参照试剂盒说明书操作测各组蛋白浓度，用细胞裂解液将各组蛋白稀释至等浓度，与2×上样缓冲液1∶1混合，100℃煮沸5min变性。取每组蛋白50μg,10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，参照参考文献[7]的方法操作。以凝胶成像系统获取图像，用ImageJ分析条带灰度值。目的蛋白的相对表达量=目的蛋白条带灰度值/内参蛋白(β-actin)灰度值。

3、统计学处理

用SPSS16.0软件对数据进行方差分析，计量资料以表示，组间比较用Dunnette-t检验。

二、结果

1、氯喹能增强顺铂对结肠癌细胞HCT116增殖的抑制作用

用5个浓度(5,10,20,40,80μmol·L-1)氯喹-1组至氯喹-5组，5个浓度(2,4,8,16,32μmol·L-1)顺铂-1组至顺铂-5组和5个浓度(20μmol·L-1氯喹+2,4,8,16,32μmol·L-1顺铂)联合-1组至联合-5组作用于结肠癌细胞HCT116，结果显示:与空白对照组比较，氯喹-3组、氯喹-4组、氯喹-5组和顺铂-2组、顺铂-3组、顺铂-4组、顺铂-5组的细胞24h的存活率均有显著性下降，差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)，见表1。表1结果表明，氯喹组、顺铂组在体外对结肠癌细胞HCT116的增殖均有有效的抑制作用，且随着药物浓度的增大、作用时间的增加，细胞的存活率均有明显下降。

与空白对照组相比，联合组的各浓度组的细胞存活率均显著下降，差异均有统计学意义(均P<0.05);联合组与同浓度下的顺铂组比较，细胞存活率均明显下降，差异均有统计学意义(均P<0.05)，见表2。

2、氯喹能够增强顺铂诱导HCT116细胞凋亡的作用

空白对照组、氯喹-3组、顺铂-3组和联合-3组的细胞凋亡率分别为(1.63%±0.50%),(15.97%±1.40%),(24.83%±2.12%)和(47.23±4.29)%。氯喹-3组和顺铂-3组与空白对照组比较，均有统计学意义(均P<0.05);联合组与空白对照组、两个单用组比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)。

联合组的细胞核皱缩浓集，细胞核呈分叶、碎片状，且明显多于氯喹组和顺铂组，见图1。

3、CQ或/和DDP处理组对HCT116细胞凋亡相关Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

空白对照组、氯喹-3组、顺铂-3组和同浓度联合组的Bcl-2蛋白相对表达量分别为1.11±0.01,0.92±0.03,0.73±0.08和0.46±0.07;这4组的Bax蛋白相对表达量分别为0.18±0.01,0.27±0.03,0.46±0.09和0.58±0.04。与空白对照组相比，氯喹组、顺铂组能够下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，上调促凋亡蛋白Bax的表达，差异均有统计学意义(均P<0.05);而联合组能进一步减少Bcl-2的表达和增加Bax的表达，差异均有统计学意义(均P<0.05)。提示氯喹或/和顺铂对HCT116细胞诱导凋亡的作用可能与下调Bcl-2和上调Bax有关，见图2。

三、讨论

结肠癌是近年来人群中最为高发的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率都在呈现持续上升的趋势，已严重威胁着百姓的生命和健康[8,9]。尽管目前对结肠癌的诊治水平有了较大提高，主要包括早期筛查、手术切除患病部位及化疗等方式，但许多患者就医时已错过了手术治疗时机，治疗效果仍不乐观[10]。DDP的抗肿瘤作用主要是通过抑制细胞DNA复制进而抑制肿瘤细胞生长实现的。但DDP运用于临床治疗时存在非常严重的耐药现象，与其药物不良反应相比，化疗耐药性才是最终导致治疗失败的主要原因[11]。此外，有研究表明，氯喹对胃癌、结肠癌和皮肤癌等多种肿瘤均有抑制作用[12]。因此，CQ被认为是一种潜在的化学增敏剂而备受重视。

本实验研究CQ、DDP单药及CQ与DDP联用分别对HCT116细胞增殖和凋亡的影响。本实验结果显示，氯喹、顺铂均对HCT116细胞具有抑制作用，同时呈现一定的浓度和时间依赖性。并且氯喹能增强顺铂对HCT116细胞的增殖抑制作用，氯喹也增强顺铂诱导HCT116细胞凋亡的作用。通过分析用药后HCT116细胞内的凋亡相关Bcl-2、Bax蛋白变化情况，氯喹、顺铂诱导HCT116细胞凋亡机制可能是通过上调促凋亡蛋白Bax的表达，同时又使抑凋亡蛋白Bcl-2的表达减少相关，氯喹联合顺铂能进一步增加Bax的表达和减少Bcl-2的表达。Bcl-2蛋白在各种细胞进程中起关键作用，包括在许多类型的癌症中细胞凋亡、入侵、细胞增殖和转移[10,11]。此外，通过诱导肿瘤抑制基因p53/Bax介导的信号传导途径，能够减少增殖并促进结肠癌细胞的凋亡[12]。近年来通过调节非编码RNA的表达来抑制结肠癌的增殖等新的机制研究也在开展[13]。本研究仅选取体外细胞实验来验证CQ、DDP单药及CQ与DDP联用对结肠癌细胞株的抗肿瘤作用，相关的研究还有待深入，为寻找抗结肠癌的新方法提供一定的实验参考。

参考文献:

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文章来源：周静,张配,葛少波,刘婕,张杰.氯喹联合顺铂对结肠癌HCT116细胞的增殖和凋亡的影响[J].中国临床药理学杂志,2022,38(03):224-227+242.