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基于Wnt通路虎杖苷对乳腺癌细胞放疗增敏的作用机制研究

2022-04-09 67 上传者：管理员

摘要：目的探讨虎杖苷（polydatin,PD）对乳腺癌细胞放疗增敏的影响及可能作用机制。方法MTT法检测不同浓度PD（5、10、20、40和80μmol/L）对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响，克隆形成实验检测细胞放疗敏感性。将MCF-7细胞随机分为对照组（常规培养）、放疗组（2Gy放射线）、LiCl组（2Gy放射线+200μmol/LLiCl）、PD组（2Gy放射线+20μmol/LPD）和PD+LiCl组（2Gy放射线+20μmol/LPD+200μmol/LLiCl）。流式细胞术检测细胞凋亡率及细胞周期变化，Westernblot法检测细胞中β-catenin、细胞周期素D1（cyclinD1）、B细胞淋巴瘤-2（Bcelllymphoma-2,Bcl-2）和Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2associatedXprotein,Bax）的表达水平。结果不同浓度PD培养24、48和72h对MCF-7细胞增殖均有抑制作用（均P<0.05）。20μmol/L的PD作用48h可降低放疗（2、4、6和8Gy）后细胞克隆形成率（platingefficiency,PE；均P<0.05）。与放疗组比较，PD组细胞凋亡率、G2/M期细胞比例和Bax蛋白表达均升高，G0/G1期细胞比例与β-catenin、cyclinD1和Bcl-2蛋白表达均降低（均P<0.05）；而PD+LiCl组可逆转PD改善的上述指标（均P<0.05）。结论PD可将MCF-7细胞阻滞在G2/M期，促进细胞凋亡，提高放疗敏感性，可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。

关键词：
乳腺癌
放疗增敏
细胞凋亡
细胞增殖
虎杖苷
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乳腺癌具有发病率高、侵袭性强和早期即可发生远处转移等特点，严重危害女性生活质量和生命健康。目前临床上主要通过手术切除辅以放疗及化疗等手段治疗乳腺癌，可提高患者生活质量及远期生存。放疗是乳腺癌的重要治疗手段之一，但由于个体及肿瘤细胞对放射线的敏感性存在差异，部分患者产生放疗抵抗性，导致疗效不佳[1]。因此，增加肿瘤细胞放疗敏感性，对于提高患者生存率具有重要意义。中药在癌症的辅助治疗中发挥重要作用，多种中药提取物与放疗结合可抑制肿瘤细胞增殖，提高放疗敏感性[2,3]。虎杖苷（polydatin,PD）是中药虎杖干燥根中分离的一种芪类化合物，在抗血栓、降血脂和抗脂质过氧化等方面发挥作用。既往研究显示，PD可诱导骨肉瘤细胞和肝癌细胞凋亡，发挥抗肿瘤作用[4,5]。另外，PD可协同2-脱氧-d-葡萄糖促进乳腺癌细胞凋亡[6]。目前，PD是否可增加乳腺癌细胞的放疗敏感性尚不明确。本研究采用PD干预乳腺癌细胞，观察PD对细胞的放疗增敏作用及可能作用机制，旨在为乳腺癌治疗提供新的治疗方法及实验依据。

1、材料与方法

1.1 细胞株

人乳腺癌MCF-7细胞株购自中国科学院上海细胞库。

1.2 药物、主要试剂和仪器

PD(>98%）购自成都瑞芬思生物科技有限公司。Wnt激动剂LiCl购自美国Sigma公司。兔抗人β-catenin单抗、细胞周期素D1(cyclinD1）单抗、B细胞淋巴瘤-2(Bcelllymphoma-2,Bcl-2）单抗、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2associatedXprotein,Bax）单抗及辣根过氧化物酶标记的IgG购自美国Abcam公司。FACSCaliburTM流式细胞仪系统购自美国BD公司。直线加速器购自美国瓦里安医疗系统公司。DYCP-31DN电泳仪购自北京六一仪器厂。

1.3 细胞培养

MCF-7细胞37℃水浴复苏，接种于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素及100μg/mL链霉素的DMEM培养液中，置入5%CO2培养箱中37℃恒温培养，每2～3天传代1次，选取对数增殖期细胞进行后续实验。

1.4 MTT法检测不同浓度PD对细胞增殖的影响

取对数增殖期MCF-7细胞，PBS清洗，0.25%胰蛋白酶消化，以1×105个/mL密度接种于96孔板，培养液中分别加入不同浓度PD(5、10、20、40和80μmol/L），每个浓度设置5个复孔，另设无PD的空白组，分别培养24、48和72h后，每孔加入10μL5%MTT溶液，继续培养4h后，每孔加入150μLDMSO，振荡混匀，酶标仪在450nm波长处测定各组细胞吸光度（absorbance,A）值。计算细胞增殖抑制率，增殖抑制率=（1-PD组A值/空白组A值）×100%。计算PD的20%抑制浓度（IC20），选取细胞增殖抑制率接近IC20的PD浓度进行后续实验。

1.5 克隆形成实验检测细胞放疗敏感性

取对数增殖期MCF-7细胞，调整细胞浓度为1×105个/mL，接种于6孔板，培养液中加入1.4筛选的PD浓度（20μmol/L），设为药物组，分别给予不同剂量（0、2、4、6和8Gy)6MV-X放射线照射细胞，照射源为直线加速器，照射野为10cm×10cm，源皮距100cm，剂量率为2Gy/min，另设空白组不照射。每组设置5个复孔。继续培养2周，PBS清洗，甲醇固定15min,Giemsa染色30min，干燥后，光学显微镜下观察细胞克隆数（>50个为1个克隆），计算细胞克隆形成率（platingefficiency,PE;PE=克隆数/接种数×100%）和细胞存活分数（survivalfraction,SF;SF=克隆数/同条件下接种数×PE）。应用GraphPadPrism软件，单击多靶模型拟合细胞存活曲线，根据平均致死剂量（meanlethaldose,D0）和准阈剂量（quasi-threshold,Dq），计算放射增敏比（sensitizationenhancementratio,SER;SERD0=空白组D0/药物组D0;SERDq=空白组Dq/药物组Dq）。

1.6 细胞分组及干预

根据1.4筛选PD浓度（20μmol/L）及1.5筛选的放射线剂量（2Gy），将细胞随机分为对照组、放疗组、LiCl组、PD组和PD+LiCl组。对照组细胞常规培养。放疗组给予2Gy的放射线照射后常规培养。LiCl组给予2Gy的放射线照射后，培养液中加入200μmol/LLiCl。PD组给予2Gy的放射线照射后，培养液中加入20μmol/LPD。PD+LiCl组给予2Gy的放射线照射后，培养液中加入20μmol/LPD,30min后加入200μmol/LLiCl。各组细胞继续培养48h。

1.7 流式细胞术检测细胞凋亡率

收集各组细胞，PBS清洗，胰酶消化，加入500μL结合缓冲液重悬细胞，加入5μLAnnexinV-FITC4℃条件下避光孵育15min，加入5μLPI染色液染色5min，流式细胞仪检测细胞凋亡情况，比较各组细胞凋亡率，凋亡率=凋亡细胞数/细胞总数×100%。每组设置5个复孔。

1.8 流式细胞术检测细胞周期变化

收集各组细胞，PBS清洗，1000r/min离心5min，弃上清，加入500μL预冷乙醇固定2h,PBS清晰，200目筛网过滤，再次离心收集细胞，加入100μLRNaseA,37℃孵育30min，加入400μLPI染色液，4℃避光染色60min，流式细胞仪检测各组细胞周期变化情况。

1.9 Westernblot法检测细胞中β-catenin、cy-clinD1、Bax和Bcl-2蛋白表达

收集各组细胞，PBS清洗，加入RIPA冰上裂解，12000r/min离心15min，收集上清，采用BCA法进行蛋白定量，加入上样缓冲液100℃水浴加热变性蛋白，制胶，进行SDS-PAGE凝胶电泳，之后转至PVDF膜，加入5%脱脂奶粉室温封闭2h，加入β-catenin(1∶500）、cyclinD1(1∶500）、Bax(1∶500）、Bcl-2(1∶500）和β-actin(1∶800）一抗，4℃摇床孵育过夜，TBST洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶2000）室温摇床孵育1h,TBST洗膜，加入ECL发光液显影，使用ImageJ软件分析，以目的蛋白灰度值/内参灰度值表示目的蛋白相对表达水平。

1.10 统计学分析

采用SPSS24.0统计学软件作数据分析。计量资料以均数±标准差表示，多样本比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 不同浓度PD对细胞增殖的影响

MCF-7细胞不同浓度PD处理后培养24、48和72h，细胞增殖抑制率随PD浓度增高而增加，呈浓度依赖性（均P<0.05，表1）。同一浓度PD干预48和72h后细胞增殖抑制率均大于24h增殖抑制率（均P<0.05）。同一浓度PD干预72h后细胞增殖抑制率与干预48h比较，差异均无统计学意义（均P>0.05）。PD对MCF-7细胞的IC20为19.35μg/mL，后续实验选取接近IC20的PD浓度20μmol/L，培养48h。

2.2 不同剂量放射线对细胞PE的影响

以PD浓度20μmol/L作用48h作为干预剂量，随着放射剂量增加，空白组与药物组细胞PE逐渐降低，药物组较空白组PE均降低（均P<0.05，表2）。SERD0和SERDq分别为1.30和1.81。照射剂量为2Gy时，MCF-7细胞SF为0.48，接近0.5，后续研究选用放射线剂量为2Gy（表3，图1）。

2.3 细胞凋亡率比较

细胞凋亡率各组间比较，差异具有统计学意义（P<0.01，表4，图2）。与对照组比较，放疗组细胞凋亡率升高（P<0.05）。与放疗组比较，LiCl组细胞凋亡率降低，PD组细胞凋亡升高（均P<0.05）。PD+LiCl组细胞凋亡率高于LiCl组，低于PD组（均P<0.05）。

2.4 细胞周期变化比较

G0/G1期和G2/M期细胞比例各组间比较，差异均具有统计学意义（均P<0.01，表5，图3）。与对照组比较，放疗组G0/G1期细胞比例降低，G2/M期细胞比例升高（均P<0.05）。与放疗组比较，LiCl组G0/G1期细胞比例升高，G2/M期细胞比例降低；PD组G0/G1期细胞比例降低，G2/M期细胞比例升高（均P<0.05）。PD+LiCl组G0/G1期细胞比例低于LiCl组，G2/M期细胞比例高于LiCl组，G0/G1期细胞比例高于PD组，G2/M期细胞比例低于PD组（均P<0.05）。

2.5 蛋白相对表达量比较

细胞中β-catenin、cyclinD1、Bcl-2和Bax蛋白相对表达量组间比较，差异均具有统计学意义（均P<0.01，表6，图4）。与对照组比较，放疗组β-catenin、cyclinD1和Bcl-2蛋白相对表达量均降低，Bax蛋白相对表达量升高（均P<0.05）。与放疗组比较，LiCl组β-catenin、cyclinD1和Bcl-2蛋白相对表达量均升高，Bax蛋白相对表达量降低，PD组β-catenin、cyclinD1和Bcl-2蛋白相对表达量均降低，Bax蛋白相对表达量升高（均P<0.05）。PD+LiCl组β-catenin、cyclinD1和Bcl-2蛋白相对表达量均低于LiCl组且高于PD组，Bax蛋白相对表达量高于LiCl组且低于PD组（均P<0.05）。

3、讨论

放疗是乳腺癌重要治疗手段之一。放射线产生的电离辐射可诱导肿瘤细胞DNA链断裂，影响DNA修复和转录、细胞周期调控以及细胞凋亡等一系列生物学进程，从而抑制肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡，发挥抗肿瘤作用[7]。局部晚期乳腺癌患者放疗后可提高无瘤生存期和总生存期，降低局部复发率[8]。但在长期治疗过程中患者会出现放疗抵抗，增加放射敏感性是提高疗效的有效办法之一。肿瘤细胞的放射敏感性与其修复DNA损伤能力有关，放射增敏剂可增加放射敏感性，抑制肿瘤细胞损伤修复，提高治疗效果，并能减少正常组织损伤[9]。鉴于PD的抗肿瘤作用，本研究探讨PD对放疗后乳腺癌MCF-7细胞行为学的调控，观察其放疗增敏作用，并分析其可能作用机制。

本研究采用PD处理MCF-7细胞显示，不同浓度PD均可抑制细胞增殖，提示PD对MCF-7细胞具有增殖抑制作用，与PD在鼻咽癌细胞中的作用一致[10]。研究表明，PD可降低大肠癌荷瘤小鼠肿瘤体积；体外实验结果显示，PD结合放射线干预可抑制大肠癌细胞增殖，诱导细胞凋亡[11]。本研究在使用不同剂量放射线干预后，随着剂量增加，细胞PE下降，证实放射线可有效抑制MCF-7细胞生长；联合使用PD后，细胞PE更低，SERD0和SERDq分别为1.30和1.81，提示PD对乳腺癌细胞具有放疗增敏作用。

细胞凋亡在乳腺癌发生和发展过程中具有重要意义，抑制肿瘤细胞增殖，诱导其发生凋亡是药物发挥抗肿瘤作用的重要机制之一[12]。电离辐射损伤肿瘤细胞DNA后，细胞周期检测位点激活，可发生细胞周期阻滞，进行损伤修复，细胞G2/M期是细胞对辐射最敏感的时期，放疗增敏与G2/M期阻滞有关[13,14]。本研究采用放射线及PD干预MCF-7细胞显示，放疗组细胞凋亡率及G2/M期细胞比例较对照组增加；在使用PD后，细胞凋亡率及G2/M期细胞比例更多，提示PD可抑制MCF-7细胞增殖，将细胞阻滞在G2/M期，促进其凋亡，具有放疗增敏作用。

Wnt/β-catenin信号通路是肿瘤常见失调途径之一。经典β-catenin依赖性Wnt传导途径在多种肿瘤发生和发展过程中被激活。该途径异常激活与肿瘤细胞侵袭行为以及肿瘤细胞抗性有关。基于Wnt/β-catenin信号通路在肿瘤发生和发展过程中的重要作用，本研究在放射线干预的基础上，采用Wnt/β-catenin信号通路特异性激活剂LiCl进行处理显示，细胞凋亡率和G2/M期细胞比例较放疗组降低，提示LiCl激活Wnt/β-catenin信号通路，减少MCF-7细胞凋亡，促进细胞分裂。本研究在使用PD处理细胞的同时加入LiCl显示，PD+LiCl组细胞凋亡率和G2/M期细胞比例较PD组降低，提示LiCl激活Wnt/β-catenin信号通路后，PD对MCF-7细胞的抑制作用减弱。

Wnt配体与受体结合，抑制β-catenin降解，继而进入细胞核，结合转录因子的T细胞因子家族成员，促进下游cyclinD1等表达，发挥促癌作用[15,16]。β-catenin是Wnt/β-catenin信号通路关键分子。β-catenin积累的大肠癌细胞具有更高的放化疗抗性[17]。另有研究显示，子宫颈鳞状细胞癌中β-catenin表达与放射抗性有关，影响患者预后生存[18]。以上研究均表明，Wnt/β-catenin与肿瘤细胞放射抗性密切相关，抑制该通路激活可作为治疗肿瘤放疗抵抗的新靶点。Bcl-2和Bax均为细胞凋亡相关基因，二者通过形成同源/异源二聚体调节细胞凋亡。本研究显示，与对照组比较，放疗组β-catenin、cyclinD1和Bcl-2蛋白表达下降，Bax蛋白表达升高，联合使用PD后，上述指标变化更显著，推测PD对MCF-7细胞的放疗增敏作用可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。为进一步验证PD与Wnt/β-catenin信号通路的关系，本研究在放疗后使用PD的基础上同时使用Wnt激动剂LiCl干预细胞。结果显示，β-catenin、cyclinD1和Bcl-2蛋白表达较PD组升高，Bax蛋白表达下降，同时细胞凋亡率及G2/M期细胞比例降低，证实PD可通过抑制Wnt/β-catenin信号通路，提高细胞放疗敏感性。

综上所述，PD可将MCF-7细胞阻滞在G2/M期，促进细胞凋亡，提高放疗敏感性，可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路有关，为临床治疗乳腺癌提供新的治疗靶点和理论依据。

参考文献:

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[1]钟华林李玲歧覃焕桦等基于P13KAKTImTOR信号通路探讨虎杖苷诱导鼻咽癌细胞凋亡的初步研究[J].中国耳鼻咽喉头颈外科,2019,26(10).536-540

文章来源：刘建波,李白羽,柯善保,李军涛.基于Wnt通路虎杖苷对乳腺癌细胞放疗增敏的作用机制研究[J].实用肿瘤杂志,2022,37(02):117-123.