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清肺排毒汤高效液相色谱指纹图谱的建立及主成分分析研究

2023-07-17 164 上传者：管理员

摘要：为抗新型冠状病毒肺炎(COVID-19)方药清肺排毒汤的质量控制及临床用药提供科学依据，建立了清肺排毒汤高效液相色谱(HPLC)指纹图谱，并对其进行主成分分析研究。按照《贵州省新型冠状病毒肺炎中医药防治参考方案(第四版)》收载的方法制备12批清肺排毒汤供试品溶液，采用高效液相色谱仪进行测定。根据中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004 A版)建立清肺排毒汤的HPLC指纹图谱，并采用SPSS 18.0软件进行主成分分析。结果显示：12批清肺排毒汤指纹图谱中有30个共有峰，与对照品比对，确认24号峰为黄芩苷，12批清肺排毒汤指纹图谱与对照指纹图谱的相似度为0.980～0.997;方法学验证表明仪器精密度较好，并且方法重复性、稳定性较好；主成分分析共得到6个主成分，方差贡献率分别为56.566%,12.847%,9.364%,6.781%,4.800%,3.980%,累计方差贡献率达到94.337%。

关键词：
主成分分析
指纹图谱
清肺排毒汤
稳定性较好
高效液相色谱法(HPLC)
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清肺排毒汤是国家卫生健康委员会及贵州省中医药管理局推荐的用于新型冠状病毒肺炎(COVID-19)一线的抗疫方药[1,2],适用于COVID-19无症状感染者以及轻型、普通型、重型患者，在危重型患者救治中可结合患者实际情况合理使用。全方由麻黄、炙甘草、杏仁、生石膏(先煎)、白术、黄芩、姜半夏等中药组成，临床用药疗效确切[3,4,5,6,7],与化学药品联用可提高治愈率、缩短诊疗时间，并且具有副作用小的特点[8,9,10,11]。

基于光谱、色谱、X射线衍射法、分子生物学等发展的指纹图谱技术广泛应用于中药、民族药及复方中药的质量控制[12,13,14,15,16,17],该方法具有整体性、模糊性等特点[18]。当前，针对清肺排毒汤的相关研究主要集中在抗COVID-19临床疗效[19,20]、作用机制[21,22,23,24]、组方中医药理论[25,26,27,28]、化学成分快速鉴别分析[29,30]、含量测定[31,32,33,34]等方面，而关于清肺排毒汤指纹图谱研究尚未见报道。

本工作以抗COVID-19方药清肺排毒汤为研究对象，建立其高效液相色谱(HPLC)指纹图谱，并采用SPSS 18.0软件进行主成分分析，以期为清肺排毒汤的质量控制、临床用药提供方法参考。

1、试验部分

1.1仪器与试剂

1260型高效液相色谱仪，配二极管阵列检测器；SHZ-D(Ⅲ)型循环真空泵；PX125DZH型电子天平；KQ 3200型超声波清洗器。

黄芩苷标准溶液：称取黄芩苷对照品适量，用甲醇溶解并定容至25 mL,配制成质量浓度为0.149 0 g·L-1的黄芩苷标准溶液。

黄芩苷对照品纯度不小于98%,批号160921;乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯；试验用水为娃哈哈纯净水。

麻黄、炙甘草、杏仁、生石膏、桂枝、泽泻、猪苓、款冬花、细辛、山药、白术、茯苓、射干、紫菀、枳实、陈皮、黄芩、姜半夏、柴胡、藿香购于国内某8家制药公司，新鲜生姜购于黔南布依族苗族自治州都匀市某超市，经笔者韩忠耀教授鉴定均为正品。按处方量[1,2],准备12批清肺排毒汤处方药材，编号S1～S12,其中S1平行准备不少于9份，其余批次均准备一份。

1.2仪器工作条件

Agela Promosil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5μm);柱温35℃;流动相A为0.2%(体积分数)磷酸溶液，B为乙腈；流量1.0 mL·min-1;检测波长220 nm;进样量5μL。梯度洗脱程序：0～10 min时，B由3%升至10%;10～20 min时，B由10%升至14%;20～30 min时，B由14%升至15%;30～35 min时，B由15%升至18%;35～40 min时，B由18%升至19%;40～45 min时，B由19%升至24%;45～50 min时，B由24%升至30%;50～60 min时，B由30%升至70%,保持3 min; 63～65 min时，B由70%降至3%,保持5 min。

1.3试验方法

根据文献[1,2],结合中药汤剂煎煮方法，确定清肺排毒汤的制备方法为：取生石膏15 g,加水600 mL,武火煮沸先煎，再加入其余药材，文火继续煎煮1 h, 4层纱布过滤，滤渣同法再煎煮1 h,合并两次煎煮液，按照成人量每天一付，早晚各一次，每次约200 mL,将煎煮液浓缩至400 mL/付，再依次用滤纸、0.45μm有机滤膜过滤，即得清肺排毒汤供试品溶液，按照1.2节仪器工作条件进行测定。

2、结果与讨论

2.1清肺排毒汤HPLC指纹图谱的建立

取12批清肺排毒汤处方药材，按照1.3节试验方法进行分析，记录色谱图；取黄芩苷标准溶液，按照1.2节仪器工作条件进行测定，记录色谱图。将色谱图以AIA格式导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004 A版),以S6清肺排毒汤色谱图为参照指纹图谱，对照指纹图谱(R)生成方法为中位数自动匹配，时间窗宽度为0.1 min。12批清肺排毒汤的叠加指纹图谱、对照指纹图谱、黄芩苷标准溶液色谱图见图1。

结果显示，12批清肺排毒汤指纹图谱共得到30个共有峰。根据文献[32,33]可知，清肺排毒汤中含有黄芩苷，与对照品比对，指认24号峰为黄芩苷。由于黄芩苷色谱峰的峰面积最大、峰形较好且分离度高，因此选择24号峰为参照峰。分别计算12批清肺排毒汤指纹图谱中其余29个共有峰与参照峰的相对保留时间和相对峰面积的相对标准偏差(RSD,n=12)。结果表明，29个共有峰的相对保留时间的RSD为0.01%～0.20%,说明仪器稳定性较好，而29个共有峰的相对峰面积的RSD为3.0%～57%,说明煎煮温度、操作者、煎煮热源等对清肺排毒汤化学成分有一定的影响。因此，为确保清肺排毒汤在临床使用时质量稳定、临床疗效好，建议清肺排毒汤煎煮时，采用标准化中药汤剂煎煮工艺。

2.2相似度评价

采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004 A版)进行相似度评价，结果见表1。

结果显示，12批清肺排毒汤指纹图谱与对照指纹图谱的相似度为0.980～0.997,表明12批清肺排毒汤质量整体稳定。

2.3方法学验证

2.3.1仪器精密度试验

取清肺排毒汤处方药材S1,按照1.3节试验方法制备供试品溶液，并按照1.2节仪器工作条件连续进样6针，计算30个共有峰与参照峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果显示，30个共有峰的相对保留时间的RSD均小于1.5%,相对峰面积的RSD均小于2.7%,表明仪器精密度较好，符合检测要求。

2.3.2重复性试验

取清肺排毒汤处方药材S1共6份，按1.3节试验方法制备6份供试品溶液并进行测定，计算30个共有峰与参照峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果显示，30个共有峰的相对保留时间的RSD均小于0.15%,相对峰面积的RSD均小于3.0%,表明该方法重复性较好。

2.3.3稳定性试验

取清肺排毒汤处方药材S1,按照1.3节试验方法制备供试品溶液，于室温放置0,2,4,6,12,18 h后按照1.2节仪器工作条件进行测定，计算30个共有峰与参照峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果显示，30个共有峰的相对保留时间的RSD均小于0.19%,相对峰面积的RSD均小于2.4%,表明供试品溶液在室温放置18 h内稳定性较好。

2.4主成分分析

将12批清肺排毒汤指纹图谱的30个共有峰峰面积作为变量，采用SPSS 18.0软件进行主成分分析，结果见表2。

图1 12批清肺排毒汤的叠加指纹图谱、对照指纹图谱和黄芩苷标准溶液色谱图

表1相似度评价结果

表2特征值、方差贡献率和累计方差贡献率

由表2可知，以特征值大于1.000为提取标准[34],共提取6个主成分，并且这6个主成分的累计方差贡献率为94.337%,大于85%[34],表明12批清肺排毒汤指纹图谱筛选的30个共有峰可代表清肺排毒汤整体化学成分信息。

30个共有峰的主成分因子载荷矩阵见表3。

由表3可知：峰2、峰3、峰4、峰6、峰7、峰9、峰10、峰12、峰13、峰14、峰15、峰16、峰17、峰18、峰19、峰20、峰21、峰22、峰24、峰25、峰26、峰27、峰28、峰29和峰30,这25个共有峰在主成分1上的载荷绝对值最大，表明其对主成分1的贡献最大，包含的清肺排毒汤化学成分信息最多；峰5和峰23在主成分2上的载荷绝对值最大；峰8和峰11在主成分3上的载荷绝对值最大；峰1在主成分4上的载荷绝对值最大。

表3主成分因子载荷矩阵

本工作基于HPLC建立了清肺排毒汤的指纹图谱，确定了30个共有峰，相似度评价结果表明清肺排毒汤质量整体稳定；同时，利用SPSS 18.0软件对其进行了主成分分析研究，成功提取了6个主成分，累计贡献率达到94.337%。该方法稳定、简便，可为清肺排毒汤的质量控制、临床施药及抗COVID-19方药现代化质量控制提供参考与方法借鉴。

参考文献:

[1]国家卫生健康委办公厅,国家中医药管理局办公室.关于印发新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第八版)的通知》的通知

[2]贵州省中医药管理局.省中医药局关于印发《贵州省新型冠状病毒肺炎中医药防治参考方案(第四版)》的通知

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