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GC法同时测定壮骨麝香止痛凝胶贴膏中5种挥发性成分

2023-08-19 181 上传者：管理员

摘要：建立GC法同时测定壮骨麝香止痛凝胶贴膏中薄荷脑、樟脑、龙脑、异龙脑、水杨酸甲酯的含量。方法该药物乙酸乙酯提取液的分析采用DB-WAX色谱柱(30 m×0.25 mm×0.50μm);载气氮气；FID检测器，温度240℃;分流比5∶1;程序升温。结果 5种挥发性成分在各自范围内线性关系良好(R2≥0.999 7),平均加样回收率97.40%～99.88%,RSD 1.6%～4.0%。结论该方法准确、稳定、可靠，可用于壮骨麝香止痛凝胶贴膏的质量控制。

关键词：
壮骨麝香止痛凝胶贴膏
异龙脑
樟脑
水杨酸甲酯
薄荷脑
龙脑
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壮骨麝香止痛膏具有祛风湿、活血止痛作用，可用于治疗风湿性关节炎、肌肉疼痛、扭伤[1,2],该制剂为橡胶型基质贴膏，在生产过程中需要用汽油等易燃溶剂，存在较大的安全隐患，并且粘附性强，容易引起皮肤过敏，揭掉时有疼痛感、皮肤易破损等缺点[3,4]。中药凝胶贴膏具有载药量大、皮肤刺激性小、贴敷舒适度和保湿性能好、透气、依从性高的优势，消除了原剂型对皮肤的过敏反应，作为壮骨麝香止痛膏改进剂型十分合适[5,6,7]。

为了制定壮骨麝香止痛凝胶贴膏质量标准，本实验采用GC法同时测定樟脑、龙脑、异龙脑、薄荷脑、水杨酸甲酯的含量。另外，对于凝胶贴膏而言，大多数文献中的提取方法为超声提取[8,9]、研匀提取[10,11]、加热回流提取[12,13]后直接测定；本实验发现，未经纯化的样品中存在大量凝胶基质材料，黏度较大，极易损坏仪器进样针、色谱柱，故在含量测定前首先对其作进一步纯化，以期消除凝胶基质带来的干扰。

1、材料

1.1仪器

Agilent7890A气相色谱系统及其工作站，配置FID检测器(美国Agilent公司);XS205电子天平(十万分之一，瑞士梅特勒-托利多公司);HA-500氢空一体机(北京中惠普分析技术研究所);R-100旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司)。

1.2试剂

樟脑(批号111749-201702,纯度99.9%)、薄荷脑(批号110728-201707,纯度99.8%)、龙脑(批号110881-201709,纯度99.6%)、异龙脑(批号111512-201603,纯度96.7%)、水杨酸甲酯(批号110707-201614,纯度100%)对照品均购自中国食品药品检定研究院。乙酸乙酯为色谱纯(德国Merck公司);水为超纯水。

1.3药物

15批壮骨麝香止痛凝胶贴膏剂(批号20210215、20210216、20210217、20210219、20210220、20210221、20210301、20210302、20210303、20210304、20210305、20210306、20210307、20210308、20210309)及空白基质贴膏剂均由课题组自制。

2、方法与结果

2.1溶液制备

2.1.1对照品溶液

精密称取各对照品适量，乙酸乙酯定容至刻度，制成每1 mL分别含薄荷脑1.702 mg、樟脑0.824 mg、龙脑0.640 mg、异龙脑0.440 mg、水杨酸甲酯0.524 mg的溶液，即得。

2.1.2供试品溶液

将本品剪成小块，精密称取5 g,置于150 mL具塞锥形瓶中，精密加入50 mL乙酸乙酯，加热回流提取1.5 h,冰浴放冷，100 mL蒸馏水萃取2次，收集乙酸乙酯层，用铺有无水硫酸钠的漏斗过滤，少量乙酸乙酯洗脱，收集滤液，减压浓缩至5 mL,定容至10 mL,0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.1.3空白基质溶液

取空白贴膏适量，按“2.1.2”项下方法制备，即得。

2.1.4阴性样品溶液

按处方工艺，分别制得缺樟脑、缺薄荷脑、缺龙脑、缺异龙脑、缺水杨酸甲酯的阴性样品，按“2.1.2”项下方法制备，即得。

2.2色谱条件

DB-WAX弹性石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.50μm);氢火焰离子检测器(FID);进样口温度220℃;检测器温度240℃;载气高纯氮气(99.999%);分流比5∶1;程序升温(初始60℃,以5℃/min升至130℃,30℃/min升至200℃,保持15 min);进样量1μL。

2.3方法学考察

2.3.1专属性试验

取阴性样品、供试品溶液适量，在“2.2”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，阴性无干扰，表明该方法专属性良好。

2.3.2线性关系考察

精密吸取对照品溶液适量，乙酸乙酯梯度稀释成6个质量浓度，在“2.2”项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y)进行回归，并分别以信噪比3∶1、10∶1为检测限、定量限，结果见表1,可知各挥发性成分在各自范围内线性关系良好。

表1各挥发性成分线性关系导

图1各挥发性成分GC色谱图

2.3.3稳定性试验

取供试品溶液适量，于0、2、4、8、12 h在“2.2”项色谱条件下各进样1μL测定，测得各挥发性成分峰面积RSD分别为樟脑1.0%、薄荷脑1.5%、龙脑2.4%、异龙脑1.4%、水杨酸甲酯2.1%,表明溶液在12 h内稳定性良好。

2.3.4精密度试验

取对照品溶液(樟脑0.412 mg/mL、薄荷脑0.851 mg/mL、龙脑0.32 mg/mL、异龙脑0.22 mg/mL、水杨酸甲酯0.262 mg/mL)适量，在“2.2”项色谱条件下进样测定6次，测得各挥发性成分峰面积RSD分别为樟脑0.52%、薄荷脑0.65%、龙脑0.43%、异龙脑0.47%、水杨酸甲酯0.83%,表明仪器精密度良好。

2.3.5重复性试验

取同一份本品(批号20210221),按“2.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定，测得各挥发性成分含量RSD分别为樟脑0.78%、薄荷脑1.3%、龙脑1.69%、异龙脑1.6%、水杨酸甲酯1.8%,表明该方法重复性良好。

2.3.6加样回收率试验

取各挥发性成分含量已知(樟脑332.62μg/g、薄荷脑701.91μg/g、龙脑272.38μg/g、异龙脑173.12μg/g、水杨酸甲酯263.45μg/g)的本品(批号20210221) 9份，每份约2.5 g,精密称定，置于150 mL具塞锥形瓶中，分为3个质量浓度，每个平行3份，分别以50%、100%、150%水平精密加入对照品溶液(樟脑0.82 mg/mL、薄荷脑1.7 mg/mL、龙脑0.64 mg/mL、异龙脑0.44 mg/mL、水杨酸甲酯0.52 mg/mL)0.5、1、1.5 mL,按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下各进样1μL测定，计算回收率。结果，薄荷脑、樟脑、龙脑、异龙脑、水杨酸甲酯平均加样回收率分别为99.06%、99.88%、99.86%、98.40%、97.40%,RSD分别为4.0%、2.9%、2.8%、3.0%、1.6%。

2.3.7样品含量测定

取15批样品，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表2。

3、讨论

3.1色谱条件选择

本实验发现，Agilent HP-5色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25μm)分离度较高，目标成分无干扰；恒温条件无法满足定量分析要求，故采用程序升温。在相同色谱条件下，分别设置分流比5∶1、10∶1、20∶1,发现在5∶1下各挥发性成分色谱峰分离度、峰形最佳。根据文献[14,15,16,17,18]报道结合预实验结果，分别选择180、240℃作为进样口、检测器温度。

表2各挥发性成分含量测定结果(mg/片)

3.2供试品溶液提取方法选择

含有挥发性成分药材的供试品溶液在前处理过程中，主要采用超声提取、挥发油提取[14,15,16,17],而凝胶贴膏前处理方法主要为超声提取[8,9]、溶剂研磨提取[10,11]、加热回流提取[12,13]。课题组前期研究发现，溶剂研磨法无法提取出壮骨麝香止痛凝胶贴膏中各挥发性成分，并且超声提取不充分，效果远不如回流提取，故最终选择后者。

3.3提取溶剂选择

本实验分别考察了甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷提取效果，发现乙酸乙酯或二氯甲烷提取时提取液清澈，容易过滤，由于后者毒性较强，故最终选择前者。

3.4提取液处理方法选择

由于凝胶基质黏性较大，直接提取的溶液重复进样后易损坏气相色谱仪进样针，色谱系统污染严重。本实验发现，回流提取液用水洗2次后再进行分析时，仪器损伤程度降低，各挥发性成分加样回收率大大提高。

4、结论

本实验建立GC法同时测定壮骨麝香止痛凝胶贴膏中樟脑、薄荷脑、龙脑、异龙脑、水杨酸甲酯的的含量，完善了该制剂质量标准，可达到全面控制其质量的目的。另外，大多数文献、法定标准[18]采用挥发油提取来对挥发性成分进行含量测定，但该方法装置复杂，操作繁琐，样品回收率低；本实验采用有机溶剂回流提取，并结合水萃取以除去损坏仪器、色谱柱的高分子骨架材料杂质，该方法操作简便，重复性、回收率均能达到相关要求。

参考文献:

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