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野生与栽培甘草对马钱子致肝毒性的解毒作用

2023-08-26 189 上传者：管理员

摘要：比较野生甘草与栽培甘草对马钱子致肝毒性的解毒作用。方法大鼠随机分为正常组、模型组、野生甘草组和栽培甘草组，每组8只，模型组大鼠灌胃给予马钱子提取物，野生甘草组和栽培甘草组大鼠在给予马钱子提取物6 h后灌胃给予各甘草提取物，连续7 d。给药结束后检测各组大鼠血清谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)活性，苏木素-伊红(HE)染色观察肝组织病理变化，酶联免疫吸附法(ELISA)检测肝组织CAT活性和TNF-α、caspase3水平，Western blot法检测肝组织CYP1A2、CYP2E1和COX2蛋白表达。结果野生甘草与栽培甘草均能降低大鼠血清AST、ALT和肝组织caspase3水平(P<0.05,P<0.01),修复受损肝脏细胞，提高TNF-α水平和CAT活性(P<0.05,P<0.01),抑制COX2、CYP1A2和CYP2E1蛋白表达(P<0.01)。结论野生与栽培甘草均可缓解马钱子所致的肝毒性，其作用机制可能与调节炎症、细胞凋亡、氧化应激、药物代谢酶因子相关，栽培甘草对氧化应激、药物代谢相关因子的调控效果优于野生甘草。

关键词：
栽培
甘草
肝毒性
解毒
野生
马钱子
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马钱子为马钱科植物马钱Strychnos nux-vomica L.的干燥成熟种子，味苦，性温，有大毒，归肝、脾经，具有通络止痛、消肿散结的功效，用于跌打损伤、骨折肿痛、风湿顽痹等[1]。马钱子的主要成分为马钱子碱和士的宁，其既是有效成分也是毒性成分，马钱子碱在肝脏具有较高浓度的特性[2],易导致肝脏毒性损伤[3]。现代研究表明，甘草具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎、护肝和免疫调节等作用[4]。甘草提取物能够有效减少马钱子碱和士的宁的吸收速度，且能缓解马钱子的肾毒性[5]。甘草对马钱子肝毒性的解毒作用尚未见报道，本实验通过观察野生甘草与栽培甘草对马钱子所致肝毒性的缓解作用，为甘草与马钱子联合应用提供依据。

1、材料

1.1药物与试剂

野生、栽培甘草于2018年10月采自甘肃省金塔县，经甘肃中医药大学中药鉴定教研室李硕副教授鉴定为正品。制马钱子于2020年7月购自甘肃中医药大学附属医院，经李硕副教授鉴定为正品，且符合炮制要求。anti-CYP2E1、anti-CYP1A2、anti-COX2、山羊抗IgG(批号ab79819、ab22717、ab179800、ab6721,英国Abcam公司);anti-GAPDH(批号YM3215,美国ImmunoWay公司);BCA蛋白定量试剂盒(批号PC0020,北京索莱宝科技有限公司);caspase3 ELISA试剂盒(批号202012,上海钦诚生物科技有限公司);CAT、TNF-αELISA试剂盒(批号均为20201217,南京建成生物工程研究所)。

1.2动物

SPF级雄性Wistar大鼠32只，体质量180～220 g,由甘肃中医药大学实验动物中心提供[实验动物生产许可证号SCXK(甘)2015-0002]。大鼠于甘肃中医药大学实验动物中心饲养[实验动物使用许可证号SYXK(甘)2015-0005],环境温度(23±2)℃,相对湿度45%～50%,12 h/12 h光暗周期循环，自由饮水，实验动物处理遵守动物伦理。

1.3仪器

BP211D型电子天平(德国Sartorius公司);DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司);HHS-11S型数显恒温水浴锅(上海宜昌仪器纱筛厂);TG16B型台式高速离心机(金坛市科析仪器有限公司);DYCZ-40G型转膜仪、DYCZ-25D型电泳仪(北京六一生物科技有限公司);MiniChemi 610型化学发光成像仪(北京赛智科技有限公司);iMark酶标仪(美国Bio-Rad公司)。

2、方法

2.1甘草提取液制备

分别称取适量野生与栽培甘草粉末，加10倍量50%乙醇超声处理30 min[6],过滤，减压浓缩。临用时以0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为助溶剂，蒸馏水稀释至给药剂量。

2.2制马钱子提取液制备

取制马钱子粉末，加10倍量50%乙醇回流提取3次，每次1 h,过滤，合并滤液，旋转蒸发仪浓缩，水浴蒸发干燥。提取物加水溶解，调节pH值为2,用二氯甲烷萃取4次。将水层分离出来，调节pH值至10,再用二氯甲烷萃取2次。收集二氯甲烷层，旋转蒸发浓缩，浓缩液在室温下干燥，干燥后收集黄白色残渣[7]。临用时以0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为助溶剂，蒸馏水稀释至给药剂量。

2.3分组、造模及给药

32只大鼠随机分为正常组、模型组、野生甘草组和栽培甘草组，每组8只。参照文献[5]报道并结合预实验结果，适应性喂养7 d后，正常组灌胃给予10 mL/kg 0.5% CMC-Na蒸馏水；模型组灌胃给予0.945 g/kg制马钱子溶液(相当于马钱子总生物碱43 mg/kg);野生、栽培甘草组灌胃给予0.945 g/kg制马钱子溶液，禁食6 h后，分别灌胃给予1.05 g/kg野生、栽培甘草提取物(相当于甘草提取物265 mg/kg),连续7 d。

2.4血清AST、ALT活性检测

末次给药后24 h, 2%戊巴比妥钠麻醉大鼠，腹主动脉采血并静置30 min, 4℃、3 500 r/min离心15 min,取上层血清，分装后存于-80℃冰箱备用。采用全自动生化分析仪检测血清谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)活性。

2.5 HE染色观察肝组织病理学

采血完成后脱颈处死大鼠，随即摘取肝脏，称重并记录，取左肝外叶组织于4%多聚甲醛溶液中固定；剩余部分用液氮速冻后置于-80℃冰箱保存备用。取固定的肝组织，石蜡包埋，切片，常规HE染色，于光学显微镜下观察并拍照

2.6 ELISA法检测肝组织CAT活性和TNF-α、caspase3水平

按照ELISA试剂盒说明书测定肝组织CAT活性和TNF-α、caspase3水平。

2.7 Western blot法检测肝组织CYP1A2、CYP2E1、COX2蛋白表达

取肝组织样本，加入RIPA组织裂解液，采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白质量浓度，蛋白变性后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，于5%脱脂牛奶中室温封闭1.5 h,分别将其置于蛋白一抗稀释液中，4℃孵育过夜，TBST洗膜，加入相应的二抗，室温孵育1 h, TBST洗膜，滴加发光液反应5 min,曝光显影，采用Image J软件分析条带灰度值，计算目的蛋白相对表达量。

2.8统计学分析

通过SPSS 21.0软件进行处理，数据以(x¯±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

3、结果

3.1野生或栽培甘草对马钱子致肝毒性大鼠血清AST和ALT活性的影响

如图1所示，与正常组比较，模型组大鼠血清AST和ALT活性均升高(P<0.01),表明马钱子对大鼠肝脏造成损伤；与模型组比较，野生甘草组和栽培甘草组大鼠血清AST和ALT活性均降低(P<0.05,P<0.01)。

3.2野生或栽培甘草对马钱子致肝毒性大鼠肝组织病理变化的影响

如图2所示，正常组大鼠肝细胞形态正常，结构清晰，细胞排列整齐，无炎性病变；模型组大鼠肝窦和中央静脉严重充血，且与正常组比较，肝细胞排列紊乱、细胞核固缩严重，细胞界限模糊不清，细胞间隙增大，细胞排列疏松；野生甘草组和栽培甘草组大鼠肝细胞排列趋向紧密整齐，结构完整，较模型组出血减少，但栽培甘草组部分细胞呈现核固缩。

图1各组大鼠血清AST、ALT活性(x¯¯±s,n=8)

图2各组大鼠肝组织病理变化(HE,×200)

3.3野生或栽培甘草对马钱子致肝毒性大鼠肝组织CAT活性和TNF-α、caspase3水平的影响

如图3所示，与正常组比较，模型组大鼠肝组织CAT活性和TNF-α水平降低(P<0.01),caspase3水平升高(P<0.01);与模型组比较，野生甘草和栽培甘草组大鼠肝组织CAT活性和TNF-α水平升高(P<0.05,P<0.01),caspase3水平降低(P<0.05,P<0.01);与野生甘草组比较，栽培甘草组大鼠肝组织CAT活性和TNF-α水平升高(P<0.05)。

3.4野生或栽培甘草对马钱子致肝毒性大鼠肝组织CYP1A2、CYP2E1和COX2蛋白表达的影响

如图4所示，与正常组比较，模型组大鼠肝组织CYP1A2、CYP2E1和COX2蛋白表达升高(P<0.01);与模型组比较，野生甘草组和栽培甘草组大鼠肝组织CYP1A2、CYP2E1和COX2蛋白表达降低(P<0.01);与野生甘草组比较，栽培甘草组大鼠肝组织CYP1A2、CYP2E1蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01)。

图3各组大鼠肝组织CAT活性和TNF-α、caspase3水平(x¯¯±s,n=8)

图4各组大鼠肝组织CYP1A2、CYP2E1和COX2蛋白表达(x¯¯±s,n=8)

4、讨论

药物性肝损伤是一种常见的由药物不良反应造成的肝脏疾病，其中毒性中草药是造成药物性肝损伤的主要原因之一[8]。马钱子中毒症状属“痉证”,中药甘味能补能和能缓，善入脾经而健脾实脾，有培土抑木之效，故味甘健脾之药可和缓马钱子之毒性[9]。甘草味甘，具有补、和、缓之功，能减轻或消除药物的毒性和峻猛之性。因此，本研究通过给予大鼠马钱子和甘草提取物，探讨甘草缓解马钱子肝毒性的作用及机制。

药物代谢是生物转化过程，其中涉及氧化反应、结合反应、药物或代谢物的清除，CYP450是药物代谢I相酶的重要代表酶，在人体肝脏的所有CYP450酶中，CYP3A4含量最丰富，其次是CYP2E1[10],同时CYP1A2和CYP2E1也是反应药物毒性的蛋白酶[11,12]。现有研究发现，毒性药物在高表达的CYP450系细胞中可导致更为严重的毒性[13],CYP450的表达存在明显的物种差异，CYP3A4在大鼠中只有很少的表达。马钱子可上调CYP1A2、CYP2E1酶活性，但是马钱子与甘草次酸联用时可显著降低CYP1A2、CYP2E1酶活性[14],本研究结果与之一致，野生甘草和栽培甘草均可以降低CYP1A2、CYP2E1表达。TNF-α是炎症诱导因子，但是本研究发现马钱子降低了TNF-α水平。研究显示，TNF-α也是1型免疫激活的关键负调节因子，1型免疫综合征可导致组织破坏，其特征是活化的CD4和CD8增多，抗原特异性T细胞增加[15],CD4细胞是免疫稳态和宿主防御的主要参与者，但也在自身免疫和炎症性疾病(包括肝脏疾病)的发病机制中起关键作用[16]。甘草具有免疫调节的药理活性，可增强自身的免疫性，另外有研究显示，甘草酸可增加感染杜氏利什曼原虫小鼠TNF-α的表达[17]。COX是由花生四烯酸合成前列腺素的关键酶，但是炎症性病变或促炎细胞因子可诱导COX2异常表达[18],在马钱子导致的斑马鱼肝脏损伤中花生四烯酸水平异常升高[19],而花生四烯酸又是一种炎症标志物[20]。本研究结果显示，野生甘草与栽培甘草均可提高TNF-α水平，抑制COX2表达。由此推测甘草可能是通过调节炎症和免疫激活稳态来调控细胞凋亡，恢复损伤。

CAT在肝组织中高表达，是参与氧化还原反应的主要酶。马钱子通过降低CAT活性导致斑马鱼的氧化应激损伤[21]。甘草具有抗氧化的药理活性，研究报道其能够提高CAT活性预防四氯化碳(CCl4)诱导的大鼠肝损伤[22]。本研究结果显示，野生甘草与栽培甘草可有效提高CAT活性。氧化还原还参与炎症性、代谢性和增殖性肝病的发病过程，通过监测肝细胞中的氧化标记物有可能诊断肝损伤的程度，并用以观察药物治疗的反应[23]。细胞凋亡是细胞的程序性死亡，caspase3是激活细胞凋亡的关键步骤，大多数与凋亡相关的形态学和生化事件都有caspase3的参与[24,25]。有研究显示马钱子可以激活caspase3的表达，诱导肝脏细胞凋亡[19]。甘草提取物对细胞具有保护作用，并且可以通过抑制caspase3表达提高细胞存活率[26]。本研究结果显示，野生甘草与栽培甘草可有效促进马钱子诱导的肝脏损伤的修复，抑制肝细胞凋亡。

综上所述，野生甘草与栽培甘草可通过提高TNF-α水平和CAT活性，降低caspase3水平，抑制CYP1A2、CYP2E1和COX2蛋白表达来调控炎症、氧化应激和促进药物代谢，进而抑制肝细胞凋亡，促进肝脏的修复，以此缓解马钱子的肝毒性。

参考文献:

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[9]刘轶凡,赵进喜,梁晓东马钱子减毒增效配伍方法初探[J].中国医院药学杂志,2018,38(24):2612-2614.

[14]邢盼盼马钱子碱与甘草次酸､甘草苷配伍后对大鼠肝脏CYP450酶基因表达与蛋白活性的影响[D]武汉:湖北大学,2011.

基金资助:国家自然科学基金项目(81960723); 甘肃省自然科学基金项目(21JR11RA145; 22JR11RA112);

文章来源:马骏,曼琼,闫潇等.野生与栽培甘草对马钱子致肝毒性的解毒作用[J].中成药,2023,45(08):2718-2722.