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基于HPLC指纹图谱结合化学计量学的痢泻灵片质量评价

2023-09-20 101 上传者：管理员

摘要：目的基于HPLC指纹图谱结合化学计量学对痢泻灵片质量进行评价。方法建立HPLC指纹图谱，系统聚类分析、主成分分析、正交偏最小二乘法判别分析筛选质量差异标志物，测定其含量。结果指纹图谱中有17个共有峰，相似度0.835～0.977。各批样品聚为3类，发现7个质量差异标志物，其中5个为番石榴酸、绿原酸、儿茶素、没食子酸、穿心莲内酯，在各自范围内线性关系良好(r=0.999 9),平均加样回收率95.0%～105.0%,RSD 0.44%～1.66%。结论该方法简便、准确、高效，可为痢泻灵片全面质量控制和科学质量评价提供参考。

关键词：
HPLC指纹图谱
主成分分析
痢泻灵片
系统聚类分析
质量差异标志物
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痢泻灵片由拳参、穿心莲、苦参3味中药组成，具有清热解毒、止痢、止泻功效，临床上用于治疗湿热痢疾、热泻等疾病，现收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂第二册，但仅有检查项，并且目前关于该制剂质量控制和评价方法的报道较少[1,2]。因此，亟需完善痢泻灵片质量标准以保障其临床疗效[3,4,5,6,7,8]。

指纹图谱可全面、整体地表征中药复方成分特征，是中药制剂质量控制、一致性评价的有效手段，而化学计量学通过对指纹图谱中复杂的中药化学数据信息进行综合分析和处理，可更全面地反映中药成分特征。另外，以多种指标成分或有效成分为对象建立的质量标准更符合中药制剂特点，也更真实全面地反映其质量[9,10]。

本实验抽取全国3个厂家30批痢泻灵片，建立该制剂HPLC指纹图谱，再结合主成分分析、聚类分析、正交偏最小二乘分析考察不同厂家、批次样品的质量差异，并对所筛选出的质量差异标志物进行含量测定[11,12,13],以期为该制剂质量标准提升提供参考。

1、材料

1.1仪器

LC-20A型高效液相色谱仪，配置PDA检测器(日本岛津公司);CP225D型电子分析天平(十万分之一，德国赛多利斯公司);SB-25-12DT型超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司);SevenEasy PH计[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司];Milli-Q超纯水系统(德国默克股份有限公司)。

1.2试剂与药物

没食子酸(批号110831-201906,纯度91.5%)、苦参碱(批号110805-202010,纯度98.7%)、氧化苦参碱(批号110780-201909,纯度92.9%)、槐果碱(批号112052-202001,纯度91.8%)、氧化槐果碱(批号111652-202202,纯度93.1%)、儿茶素(批号110877-202005,纯度95.1%)、绿原酸(批号110753-202119,纯度96.3%)、穿心莲内酯(批号110797-202010,纯度99.6%)对照品及拳参(批号121569-201602)、穿心莲(批号121082-201706)、苦参(批号121019-201708)对照药材(中国食品药品检定研究院)。痢泻灵片共30批，来源于3家生产企业(A、B、C),编号P1～P30。番石榴酸(批号18935,纯度99.8%,深圳市江川医药技术有限公司)。甲醇为色谱纯(德国默克公司);磷酸为优级纯，磷酸二氢钾、甲醇为分析纯(国药集团化学试剂有限公司);水为超纯水。

2、方法与结果

2.1色谱条件

XSelect CSH C18色谱柱(4.6 mm×150 mm, 3.5μm);流动相甲醇(A)-0.2%磷酸二氢钾(磷酸调节pH为3.0)(B),梯度洗脱(0～20 min, 5%～20%A;20～25 min, 20%A;25～35 min, 20%～25%A;35～40 min, 25%A;40～90 min, 25%～90%A;90～100 min, 100%A);体积流量0.5 mL/min;柱温30℃;检测波长0～45 min 215 nm, 45～60 min 300 nm, 60～80 min 215 nm;进样量5μL。

2.2溶液制备

2.2.1对照品溶液

取没食子酸、苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱、番石榴酸、儿茶素、绿原酸、穿心莲内酯对照品适量，40%甲醇制成质量浓度分别为0.02、0.1、0.05、0.02、0.02、0.2、0.02、0.1、0.2 mg/mL的溶液，即得。

2.2.2供试品溶液

取本品20片或除去包衣研细，精密称取1.0 g,精密加入40%甲醇25 mL,称定质量，超声处理45 min,取出，放冷，40%甲醇补足减失的质量，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2.3对照药材溶液

精密称取拳参、穿心莲对照药材各0.3 g,按“2.2.2”项下方法制备，即得相应溶液。精密称取苦参对照药材0.4 g,加15 mL水加热回流提取1 h,取出，放冷，以铺有少量脱脂棉的漏斗过滤，滤液浓缩至约1 mL,再加入40%甲醇25 mL,按“2.2.2”项下方法制备，即得相应溶液。

2.2.4阴性样品溶液

按本品处方比例，分别制成缺拳参、缺穿心莲、缺苦参的阴性样品，按“2.2.2”项下方法制备，即得。

2.3 HPLC指纹图谱建立

2.3.1精密度试验

取同一批样品(P22),按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定6次，以绿原酸为参照，测得各共有峰相对峰面积RSD<2.0%,相对保留时间RSD<2.0%,每2针之间的相似度为1.000,表明仪器精密度良好。

2.3.2重复性试验

取同一批样品(P22),按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，以绿原酸为参照，测得各共有峰相对峰面积RSD<2.0%,相对保留时间RSD<2.0%,每2针之间的相似度为0.999～1.000,表明该方法重复性良好。

2.3.3稳定性试验

取同一批样品(P22),按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，于0、4、10、16、24 h在“2.1”项色谱条件下进样测定，以绿原酸为参照，测得各共有峰相对峰面积RSD<2.0%,相对保留时间RSD<2.0%,每2针之间的相似度为0.999～1.000,表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.4图谱生成

取30批样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，将数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件(2012年版),设定时间窗宽度为0.1 min,采用平均数法生成对照指纹图谱，见图1A,将其(S1)和色谱峰较多、信号较强、峰面积较大的P2、P7～P8、P11～P12、P14～P16、P20～P22、P24、P28～P29(S2～S15)生成指纹图谱，见图1B。再采用多点校正对色谱峰进行匹配，发现17个共有峰，各批样品相似度见表1。

2.3.5共有峰归属

取供试品(P22)、对照药材、阴性样品溶液适量，在“2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图2,根据“2.3.4”项下结果对17个共有峰进行编号，通过比对药材图谱及其阴性图谱并结合色谱峰保留时间，发现1号峰(苦参碱)、4号峰(槐果碱)、6号峰(氧化槐果碱)、7号峰(氧化苦参碱)、8号峰(番石榴酸)、15号峰来自苦参，2号峰(没食子酸)、3号峰、5号峰、9号峰、10号峰(儿茶素)、11号峰、12号峰(绿原酸)峰来自拳参，12号峰(绿原酸)、13号峰、14号峰、16号峰(穿心莲内酯)、17号峰来自穿心莲。

图1痢泻灵片对照指纹图谱(A)及HPLC指纹图谱(B)

1.苦参碱2.没食子酸4.槐果碱6.氧化槐果碱7.氧化苦参碱8.番石榴酸10.儿茶素12.绿原酸16.穿心莲内酯

表1 30批样品相似度

图2 HPLC指纹图谱共有峰

2.4化学计量学研究

2.4.1系统聚类分析(HCA)

以共有峰峰面积为原始数据，生成30×30阶数据矩阵，采用IBM SPSS Statistics 19.0软件进行HCA分析，结果见图3。由此可知，当平方欧式距离为25时，可将30批样品聚为3类，其中企业A的P1、P3～P6和企业B的P17～P19聚为一类，企业B的P13～P16、P20～P22和企业C的P26～P30聚为一类，企业A的P2、P7～P12和企业C的P23～P25聚为一类，结合“2.3.4”项下结果，发现第1类样品相似度最低，第3类样品最高。

图3 30批痢泻灵片HCA树状图

2.4.2主成分分析(PCA)

以共有峰峰面积为变量，导入SIMCA 14.1软件进行PCA分析，结果见图4。由此可知，累积解释能力参数R2X、R2Y分别为0.987、0.788,均大于0.5,表明模型稳定可靠，其中P2、P13～P22聚为一类，P23～P30、P8～P11聚为一类，P1、P3～P7、P12聚为一类，与“2.4.1”项下结果基本一致。

图4 30批痢泻灵片PCA得分图

2.4.3正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)

将共有峰峰面积导入SIMCA 14.1软件，进行OPLS-DA分析，结果见图5,可知所有批次样品均落在置信区间内，可按照来源精确地被分为3类，并且组内差异较小。在α=0.95置信区间内，以变量投影重要性(VIP)>1.0的色谱峰为差异标志物，见图6,按VIP值从大到小排序，依次为峰8(番石榴酸)、峰15、峰10(儿茶素)、峰16(穿心莲内酯)、峰12(绿原酸)、峰3、峰2(没食子酸),其中有2个峰(峰8、峰15)来自苦参，4个峰(峰2、峰3、峰10、峰12)来自拳参，2个峰(峰12、峰16)来自穿心莲，可能为引起痢泻灵片质量差异的主要变量。

图5 30批痢泻灵片OPLS-DA得分图

图6 OPLS-DA VIP值

2.5主要成分含量测定

采用HPLC法。

2.5.1色谱条件

同“2.1”项。

2.5.2线性关系考察

分别精密吸取番石榴酸(0.209 6 mg/mL)、儿茶素(0.211 5 mg/mL)、绿原酸(0.104 7 mg/mL)、没食子酸(0.004 69 mg/mL)、穿心莲内酯(0.193 6 mg/mL)对照品溶液1、2、5、10、15μL,在“2.1”项色谱条件下进样测定。以对照品进样量为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y)进行回归，结果见表2,可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2各成分线性关系

2.5.3专属性试验

取对照品、供试品、阴性样品溶液适量，在“2.1”项下色谱条件进样测定，结果见图7。由此可知，除了绿原酸为拳参、穿心莲共有成分外，其余成分色谱峰均无干扰，表明该方法专属性良好。

图7各成分HPLC色谱图

2.5.4精密度试验

取“2.5.2”项下对照品溶液适量，在“2.1”项色谱条件下进样测定5次，每次5μL,测得没食子酸，番石榴酸，儿茶素，绿原酸、穿心莲内酯峰面积RSD分别为0.67%、0.15%、0.09%、0.13%、0.12%,表明仪器精密度良好。

2.5.5重复性试验

取同一份本品(P22),按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得没食子酸、番石榴酸、儿茶素、绿原酸、穿心莲内酯含量RSD分别为1.03%、0.89%、0.93%、0.25%、0.74%,表明该方法重复性良好。

2.5.6稳定性试验

取同一份供试品溶液(P22),于0、4、10、16、24 h在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得没食子酸、番石榴酸、儿茶素、绿原酸、穿心莲内酯峰面积RSD分别为2.06%、1.87%、1.51%、0.83%、1.44%,表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.5.7加样回收率试验

精密称取各成分含量已知的同一份本品(P22)6份，每份0.5 g,精密加入“2.2.1”项下对照品溶液适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，没食子酸、番石榴酸、儿茶素、绿原酸、穿心莲内酯平均加样回收率分别为103.1%、97.29%、101.4%、104.0%、100.8%,RSD分别为1.09%、0.63%、1.54%、0.44%、1.66%。

2.5.8样品含量测定

取30批样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表3。

表3各成分含量测定结果(mg/g)

3、讨论

本实验从全国29个省市不同流通领域中抽取不同企业生产的30批痢泻灵片作为对象，具有代表性。结果，各批样品HPLC指纹图谱中有17个共有峰，并指认出其中9个；以相似度不得低于0.90为标准，有7批低于限度，占所有批次的23.3%,表明不同企业或同一企业不同批次样品之间存在差异。

然后，采用系统聚类分析、主成分分析、偏最小二乘法判别分析来提取相关化学数据，发现30批痢泻灵片聚为3类，质量标志物有7个，其含量测定结果表明不同企业样品批间质量不一，存在投料方式不规范、投料药材质量差的问题。因此，痢泻灵片在整体质量控制方面还存在一些不足，需在今后加以改进。

4、结论

本实验采用HPLC指纹图谱结合化学计量学对痢泻灵片质量进行评价，所筛选出的指标成分能代表该制剂所有药味特征，并且该方法准确简便，重复性好，可为其更全面的质量控制提供实验依据[14,15,16,17,18,19,20,21,22]。

参考文献:

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典:2020年版一部[S].北京:中国医药科技出版社,2020:354.

[2]中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准(中药成方制剂第二册)[S].北京:中华人民共和国卫生部,1990.

[3]于远洋,鄢长余,刘娜,等.HPLC法测定分析痢泻灵片中苦参碱及氧化苦参碱的含量([U].中国药物评价,2022,39(4).318-321.