随着时代发展不断加快，人们生活压力愈来愈大，失眠是现代社会中非常普遍的一种现象。失眠是现代人亚健康状态的一种表现。失眠又称“不寐”，主要以不能正常入睡影响体力精力为特征，给患者带来极大痛苦与心理负担[1]。近年来，由于药茶具有冲泡简单方便、疗效显著、副作用少及不会产生药物耐药性等特点，成为改善或治疗失眠、焦虑的研究热点[2]。

安神助眠药茶由百合、酸枣仁、紫苏、山楂四味药组成，均为药食同源目录（2022年版）所收载品种。基于课题组前期实验和研究发现，安神助眠茶中四味药联用具有清心安神助眠之功效，可起到较好的抗疲劳、改善焦虑、提高睡眠质量等作用。方中百合为君药，有补养心阴、清除内热的功效，常用于治疗虚烦、失眠多梦、心悸、精神恍惚等情况。酸枣仁为臣药，可养血补肝、宁心安神。佐以紫苏叶疏肝解郁、宽胸下气。山楂生用，消食健胃、行气散瘀。安神助眠茶中主要含有多糖类、皂苷类、黄酮类、有机酸等成分，化学成分丰富多样。其中，百合和酸枣仁是方中起安神助眠之功效的主要药物。百合中的百合多糖是其重要生物活性成分之一，具有抗氧化以及免疫调节等作用[3]。查阅相关文献发现这些药理作用有利于睡眠的改善[4]。酸枣仁中含有黄酮类以及皂苷类成分[5]，其中酸枣仁皂苷和斯皮诺素是其发挥镇静作用的主要有效成分，具有很好的助眠作用[6]。此外，紫苏中含有的多糖有助于清除人体产生的某些疲劳代谢物质，缓解疲劳[7]，也有助于改善睡眠。基于对药茶中改善睡眠活性成分的分析，本文建立了关于酸枣仁皂苷A、斯皮诺素、总多糖含量测定方法，测定了药茶中主要活性成分含量。同时对安神助眠药茶急性及长期毒性进行系统考察，可为其临床应用的安全性提供依据。

1、材料

1.1动物

SPF级昆明小鼠40只，体重18～20 g，雌雄各半；SPF级SD大鼠80只，体重90～100 g，雌雄各半[斯贝福生物技术有限公司，动物合格证号为110324220102650167，动物许可证号SCXK（京）2019-0010]。

动物均饲养于山西中医药大学动物房内，雌雄分笼饲养，适应性饲养一周。在饲养过程中，12 h昼夜交替，可自由获取食物与水。垫料每2日更换一次。

1.2试药

乙腈（色谱纯，纯度≥99.9%，北京百灵威科技有限公司）；斯皮诺素对照品（批号：72063-39-9）、酸枣仁皂苷A对照品（批号：55466-04-1）（纯度均≥98%，上海诗丹德标准技术服务有限公司）；葡萄糖对照品（批号：RS0525-1000，纯度≥99.4%，成都普思生物科技股份有限公司）；水为娃哈哈纯净水；甲醇、磷酸、苯酚、浓硫酸等均为分析纯。

百合（批号：220401）、紫苏（批号：200401）、山楂（批号：211102）、酸枣仁（批号：211202）（山西元和堂中药有限公司，经山西中医药大学裴香萍教授鉴定为正品）。

1.3仪器

肌酐（CREA）试剂盒、尿素氮（UREA）试剂盒（脲酶法）、谷丙转氨酶（ALT）试剂盒、谷草转氨酶（AST）试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

AB135-S电子天平（十万分之一，瑞士METTLER公司）；FA224型天平（万分之一，上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；HC-2518高速离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司）；CT-100旋转蒸发仪（JULABO);ELSD 2000ES蒸发光散射检测器（奥泰科技有限公司）；Waters 2695高效液相色谱仪、Waters2998紫外检测器（美国沃特世科技公司）；DZTW-SKM型数显恒温电热套（鄄城华鲁电热仪器有限公司）；KQ5200V超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限公司）；TU-1810紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）。

2、方法

2.1安神助眠药茶中斯皮诺素、酸枣仁皂苷A含量测定

2.1.1色谱条件

①斯皮诺素：Atlantis t3 C18色谱柱（4.6mm×250 mm,5μm),PDA检测器；检测波长335 nm，流速1 mL·min-1，柱温30℃，进样量10μL，梯度洗脱程序见表1。

②酸枣仁皂苷A:Atlantis t3 C18色谱柱（4.6mm×250 mm,5μm），蒸发光散射检测器；流速1 mL·min-1，检测器温度100℃，进样量10μL，梯度洗脱程序见表2。

2.1.2供试品溶液的制备

称取百合3 g，酸枣仁、紫苏、山楂各1 g，加9倍量的水，提取3次，每次1.5 h，合并滤液，浓缩，定容至100 mL，经0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得。  

表1斯皮诺素梯度洗脱程序   

表2酸枣仁皂苷A梯度洗脱程序

2.1.3对照品溶液的制备

分别精确称定对照品斯皮诺素、酸枣仁皂苷A适量，加入甲醇配制成1 mg·mL-1的对照品溶液。

2.1.4线性关系考察

精密称取两种对照品适量，分别用70%甲醇进行溶解，依次稀释得到斯皮诺素的质量浓度分别为0.0124、0.0246、0.0491、0.0983、0.1899、0.3930 mg·m L-1，酸枣仁皂苷A质量浓度分别为0.0225、0.0435、0.0846、0.1661、0.3500、0.7000 mg·m L-1。分别以对照品质量浓度和质量浓度对数为横坐标，峰面积和峰面积对数为纵坐标，进行线性回归计算，斯皮诺素的线性方程为y=1×107x+1.456×104,r=0.9998，线性范围为0.0124～0.3930 mg·m L-1；酸枣仁皂苷A的线性方程为y=1.446x+6.731,r=0.9995，线性范围为0.0225～0.7000 mg·m L-1。对照品及供试品色谱图见图1。

2.1.5精密度实验

分别取两种对照品溶液适量重复进样6次，记录其峰面积，计算RSD值分别为1.1%、1.8%，结果表明仪器精密度良好。

2.1.6稳定性实验

取供试品溶液适量，在0、2、4、8、12、24 h分别进样，测定峰面积并计算RSD值，分别为1.1%和1.7%。结果表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.7重复性实验

取相同的供试品平行制备6份，进样分析，测定峰面积，计算含量的RSD值分别为1.6%和1.1%，表明方法重复性较好。

2.1.8加样回收实验

取已知含量的供试品，平行制备9份，分别加入低、中、高浓度的对照品溶液适量后混匀，在“2.1.1”项色谱条件下测定，计算回收率，斯皮诺素低、中、高浓度的平均回收率分别为92.7%、93.7%、95.9%,RSD均<2%；酸枣仁皂苷A低、中、高浓度的平均回收率分别为92.2%、92.0%、93.4%,RSD均<2%，表明方法准确度良好。

图1斯皮诺素和酸枣仁皂苷A的HPLC色谱图  

2.2安神助眠茶中总多糖含量的测定

2.2.1对照品溶液的制备

取无水葡萄糖对照品适量，精密称定，加蒸馏水配成0.04 mg·mL-1的对照品溶液。

2.2.2供试品溶液的制备

取安神助眠药茶溶液50 mL，浓缩至约10 mL，放冷，加入40 mL的无水乙醇，3000 r·min-1离心5 min，残渣用80%乙醇进行洗涤，离心并重复2次，用水洗涤残渣，定容至20 mL，作为总多糖的供试品溶液。2.2.3线性关系考察精密吸取上述对照品溶液2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 mL于试管中，分别加水补足至10 mL，精密加入6%的苯酚溶液1 mL，涡旋后匀速加入98%浓硫酸5.0 mL，混匀，静置至室温。以空白试剂作为参比溶液，在490 nm波长下测定吸光度，以对照品溶液质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。总多糖的线性方程为y=50.757x-0.2073,r=0.9992，线性范围为0.008～0.018 mg·mL-1。

2.3急性毒性实验

安神助眠茶处方中的4味中药均为药食同源目录（2022年版）所收载品种，没有毒性，为研究配伍后安神助眠药茶的毒性情况，采用最大耐受量法，给予小鼠最大给药剂量与最大灌胃体积后连续观察14 d[8]。

按照3∶1∶1∶1的重量比称取适量的百合、酸枣仁、紫苏和山楂，加9倍量蒸馏水浸泡30min，加热至沸腾后回流提取1.5 h,6层纱布过滤，稍冷却后过滤并保存所得药液。重复上述操作2次，合并3次滤液。即得安神助眠药茶溶液。

取适量安神助眠药茶溶液浓缩至1.2 g·m L-1，小鼠灌胃可承受的最大体积0.4 mL/10 g，一次性灌胃的最大给药剂量为48 g·kg-1。

40只小鼠（雌雄各半）随机分成给药组和空白组，禁食不禁水24 h，给药组小鼠分2次按最大灌胃体积灌服安神助眠茶，每次间隔6 h，空白组则以等体积的生理盐水灌胃。灌胃后30 min内观察各组小鼠行为及活动情况，连续观察14 d，每日上午10:00称重。实验结束后将小鼠处死，解剖后观察各组织器官的变化，主要脏器是否发生病变，计算脏器指数[9]。

2.4 30 d喂养实验

80只大鼠（雌雄各半）随机分为低、中、高剂量组和空白组，灌胃剂量按照60 kg成人与250 g大鼠换算。给药量分别为低剂量组（5 g·kg-1,0.25g·m L-1）、中剂量组（10 g·kg-1,0.5 g·m L-1）、高剂量组（20 g·kg-1,1 g·m L-1）（分别相当于人临床摄入剂量的50、100、200倍），空白组按同等剂量灌胃生理盐水，连续给药30 d[10]。

2.4.1一般情况观察

每周进行一次体重测定并根据体重换算灌胃剂量，给药期间每日对大鼠的毛发、行为、粪便等情况进行观察。

2.4.2血液学检查

腹主动脉采血2 mL置于EDTA抗凝管中，对血液学指标红细胞（RBC）、白细胞（WBC）、血小板（PLT）、血红蛋白（HB）等指标进行检测。

2.4.3血液生化指标检测

腹主动脉采血5 mL，静置30 min后，3500 r·min-1离心15 min，吸取上层透明血清，采用试剂盒对大鼠ALT、AST、CREA、BUN等血液生化指标进行检测。

2.4.4脏器系数测定

实验结束后，对大鼠进行解剖，取其主要脏器，进行脏器指数的计算。

2.4.5病理学观察

实验结束后处死大鼠，肉眼观察各组织器官有无异常情况[11]。

2.5统计方法

实验得到的数据结果采用SPSS的单因素方差分析进行分析，采用Graph Pad Prism 8.0绘制统计图，P<0.05表示差异具有统计学意义[12]。

3、结果与讨论

3.1含量测定结果

经过测定，样品中酸枣仁皂苷A和斯皮诺素总含量为1.094 mg·g-1,RSD值为1.6%。样品中总多糖含量为13.68 mg·g-1,RSD值为0.73%。

3.2小鼠急性毒性实验

3.2.1小鼠体重变化情况

实验观察期间，所有小鼠皮毛光洁、行动自如、精神状态良好，饮食饮水正常、排泄物未见异常。两组小鼠均未死亡。灌胃剂量按照60 kg成人与20 g小鼠的表面积折算法进行换算。经计算发现小鼠每日合计最大灌胃剂量为96 g·kg-1，相当于人临床日服量（100mg·kg-1）的960倍。实验期间，各组小鼠体重均增加，具体结果见表3。  

表3安神助眠茶对小鼠体重的影响(g,n=10)  

3.2.2小鼠脏器指数

脱颈处死后，解剖小鼠观察所有器官未见异常，与对照组相比，给药组小鼠脏器指数差异没有统计学意义，结果见图2。

3.3大鼠30 d喂养实验

3.3.1一般情况

实验期间，各组大鼠生长情况正常，毛发颜色正常，饮食与饮水情况正常，排泄物无异常。

3.3.2体重变化情况

实验期间，各剂量组大鼠体重均增加，各剂量雌性大鼠总增重范围在（103.2±4.32)g至（113.5±21.92)g，雄性大鼠的增重范围在（153.3±12.74)g至（164.3±9.00)g，结果见图3。高剂量雌性大鼠体重由（95.40±6.19)g增长至（219.00±20.1)g，体重增长率为128.8%，与空白组相比，差异具有统计学意义（P<0.05），其余各组大鼠体重与对照组相比，差异均无统计学意义。

图2安神助眠药茶对小鼠脏器指数的影响  

图3安神助眠药茶对大鼠体重的影响   

3.3.3脏器指数

结果见图4，与空白组相比，给药各组大鼠各脏器指数差异无统计学意义。

图4安神助眠药茶对大鼠脏器指数的影响  

3.3.4血常规检测结果

结果见表4，与空白组相比，中剂量组雌性大鼠红细胞数量偏低，高剂量组雄性大鼠红细胞含量偏低，中剂量组雄性大鼠血红蛋白含量偏高（P<0.05），但均在正常值范围内。各剂量组雄鼠和雌鼠其他血常规指标与空白组相比差异均无统计学意义。

3.3.5血液生化指标检测结果

与空白组相比，各剂量组大鼠各检查指标差异均无统计学意义。结果见图5。

图5安神助眠药茶对大鼠血液生化指标的影响  

4、讨论

本文建立了HPLC测定安神助眠药茶中斯皮诺素、酸枣仁皂苷A含量的方法，建立了UV测定药茶中总多糖含量的方法，并考察了安神助眠药茶的安全性。

急性毒性实验结果显示，小鼠的健康状况良好，没有异常死亡情况发生。按照现有的中药毒性和安全性测试方法，中药的安全性的判定标准是小鼠可以耐受成人剂量的100倍以上即可。经过计算在本条件下，安神助眠药茶在成人临床日用量的960倍下对小鼠没有产生明显的毒性作用，证明该药茶是可以安全使用的。  

表4安神助眠药茶对大鼠血常规指标的影响  

评价药物安全性的重要基础指标之一是30 d喂养实验[13,14,15]。从生长情况及体重变化情况来看，安神助眠药茶不会影响动物的正常生长及发育。脏器指数可以反映出外界影响后脏器水肿或萎缩等情况，从结果来看，药茶对脏器没有不良影响。

药茶在人体代谢的主要器官是肝和肾，ALT和AST是血液生化指标中反映肝脏功能好坏的重要指标，UREA和CREA则是反映肾脏功能好坏的重要指标[16]，本文检验结果表明药茶对以上血液生化指标无影响，因此可以判定安神助眠药茶对肝、肾无毒性。血液学指标检查可以反映细胞数量是否异常。实验后，血常规检查结果未见异常变化，说明药茶对血液学指标无影响。综上，在实验条件下，安神助眠药茶没有毒副作用，临床使用安全可靠。

参考文献:

[1] 罗芳丽,申治富,廖伯年,等.中医药治疗亚健康失眠的研究进展[J].黔南民族医专学报,2022,35(3);232-235.

[2] 方艺洁,彭伟.药食两用中药材治疗失眠的作用机制及应用研究进展[J].食品与药品,2022,24(5):498-504.

[3] 张靖,彭鼎,陈凯,等.百合多糖免疫活性研究进展[J].中国动物传染病学报,2021,29(3):114-118.

[4] 余思佳,徐建雄.微生物源性抗氧化剂对小鼠睡眠及抗氧化性能的影响[J].中国比较医学杂志,2016,26(6):28-31.

[5] 张婷,张岩,王文彤,等.酸枣仁中黄酮成分及其药理作用研究进展[J].天津药学,2018,30(1):69-74.

[6]黄之错,马伟光.酸枣仁及活性物质的药理研究进展[J].中国民族民间医药,2018,27(3):57-60.

[7]赵奕栋,孙文豪,陈天源,等.紫苏叶有效成分药理作用研究进展[J].江苏中医药,2022,54(8):79-82.

基金资助:山西中医药大学科技创新能力培育计划“太行本草”专项基础和应用研究项目(No.2022PY-TH-26);山西中医药大学科技创新能力培育计划“成果转化引导专项”项目(No.2020PY-ZH-09);山西中医药大学2020年度科技创新能力培育计划“山西药茶的研制和开发”项目(No.2020PY-YC-10);晋药综合开发利用协同创新中心项目(No.2017-JYXT-15);山西省地产中药品质评价技术创新中心[晋科函[2022]168号];

文章来源:王楠,高太祥,张洪雄等.安神助眠药茶活性成分含量测定及安全性评价[J].中南药学,2023,21(09):2322-2327.