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参丹方通过改善心肌病大鼠心肌细胞凋亡研究

2023-11-16 80 上传者：管理员

摘要：目的探讨参丹方对扩张型心肌病(DCM)模型大鼠心脏的保护作用及机制。方法用腹腔注射2.5 mg·kg-1阿霉素建立DCM模型大鼠。将模型大鼠随机分为模型组和低、中、高剂量实验组，每组8只；另取8只正常大鼠作为正常组。低、中、高剂量实验组分别灌胃给予1.46、2.92、5.84 g·kg-1参丹方溶液，剂量以10 mL·kg-1·d-1计算，正常组和模型组均灌胃给予等量0.9%NaCl。5组大鼠每日给药1次，连续给药28 d。用酶联免疫吸附试验法检测N末端脑钠肽前体(NT-proBNP)、肌钙蛋白T(cTn-T)和肌酸激酶(CK)的含量，用蛋白质印迹法检测磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)蛋白的表达情况。结果中、高剂量实验组和模型组、正常组的NT-proBNP水平分别为(963.40±46.67)、(903.11±82.76)、(1 457.56±66.28)和(789.79±40.53)pg·mL-1,cTn-T水平分别为(559.68±31.05)、(521.51±19.29)、(685.53±17.16)和(452.67±30.76)pg·mL-1,CK水平分别为(39.23±6.85)、(34.61±8.55)、(55.79±0.61)和(27.79±1.76)ng·mL-1,PI3K蛋白相对表达水平分别为2.62±0.21、3.30±0.10、0.76±0.24和3.54±0.16,AKT蛋白相对表达水平分别为2.20±0.36、3.13±0.32、0.92±0.24和3.79±0.19。模型组的上述指标与中、高剂量实验组相比较，差异均有统计学意义(均P<0.01)。结论参丹方可能通过PI3K/AKT信号通路，改善DCM大鼠心肌细胞凋亡及心肌纤维化。

关键词：
参丹方
心肌细胞凋亡
扩张型心肌病
磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B
阿霉素
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扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy, DCM)发病率逐年增高，且预后不良。目前，西医治疗手段虽然能在一定程度上可改善DCM患者的心脏功能，但仍未改善DCM患者的生活质量及死亡率[1]。根据DCM的临床表现，可归为中医“心悸”“胸痹”“喘证”“心胀”“心水”等范畴[2,3]。中医药对DCM有丰富的理论研究和治疗经验，在改善患者症状和预后等方面具有明显的优势[4]。马静教授长期致力于DCM的中西医治疗研究，提出该病的基本病因病机为“气虚血瘀”,正虚为本，血瘀为标。本研究建立DCM模型，探讨参丹方对DCM的干预作用，为参丹方的后续临床应用提供新的科学依据。

一、材料与方法

1 材料

动物雄性SD大鼠，鼠龄6周，体质量(200±20)g, 购自空军军医大学实验动物中心。动物许可证号：SCXK(陕)2019-001。本研究经陕西中医药大学实验动物伦理委员会审核批准(伦理批号：SUCMDL20211115002)。

试剂丹参，批号：A2066021,产地：山东，人参，批号：A1129571,产地：黑龙江，炙黄芪，批号：A2089211,产地：甘肃，当归，批号：A2121621,产地：甘肃，红花，批号：A2080891,产地：四川，车前子，批号：A1050161,产地：辽宁，桂枝，批号：A3010911,产地：云南，均由广东一方药业制药有限公司生产，均经陕西中医药大学沈霞教授鉴定为正品。盐酸阿霉素，规格：每瓶50 mg, 批号：A183027,由阿拉丁生化科技股份有限公司生产；N末端脑钠肽前体(N-terminal brain natriuretic peptide precursor, NT-proBNP)、肌钙蛋白T(cardiac troponin -T,cTn-T)、肌酸激酶(creatine kinase, CK)试剂盒，均由上海谷研实业有限公司生产；苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色试剂盒、Masson染色试剂盒，均购自Beyotime(中国)公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒，购自碧云天有限公司；磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3 kinase, PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B,AKT),均由美国CST公司生产。

仪器Vevo3100超高分辨率小动物超声影像系统，加拿大VisualSonics公司产品；Tecan infinite M200 Pro酶标仪，澳大利亚Tecan公司产品；Powerpac基础型蛋白电泳仪，美国Bio-Rad公司产品。

2 实验方法

2.1 溶液配制

将参丹方颗粒按照方剂比例(丹参10 g、人参10 g、炙黄芪20 g、当归15 g、红花10 g、车前子30 g、桂枝6 g)进行混合，溶于蒸馏水中制成混悬液，按照1.46、2.92、5.84 g·kg-1参丹方溶液的给药剂量配制，现用现配。

2.2 模型建立[5]5]

根据大鼠体质量给予腹腔注射2.5 mg·kg-1阿霉素，每周1次，连续6次，累积计量达到15 mg·kg-1后建立DCM模型。模型制备成功后进行心动超声测量，当大鼠左心室射血分数(left ventricular ejection fraction, LVEF)<60%,左心室舒张末期内径(left ventricular internal dimension-diastole, LVIDd)、左心室收缩末期内径(left ventricular internal dimension in systole, LVIDs)升高，短轴缩短率(fractional shortening, FS)降低且P<0.05,表明DCM大鼠模型制备成功。

2.3 动物分组与给药方法

将模型大鼠随机分为模型组和低、中、高剂量实验组，每组8只；另取8只正常大鼠作为正常组。低、中、高剂量实验组分别灌胃给予1.46、2.92、5.84 g·kg-1参丹方溶液(分别为0.5倍临床药量、临床等效药量和1.0倍临床药量),剂量以10 mL·kg-1·d-1计算；正常组和模型组均灌胃给予等量0.9%NaCl。5组大鼠每日给药1次，连续给药28 d。

2.4 用超声心动图检测大鼠的心功能[6]6]

提前将大鼠左胸前脱毛并擦拭干净，经异氟烷吸入麻醉后，仰卧位固定，将探头放于心前区，超声仪频率为6～12 MHz, 记录LVEF、FS、LVIDd及LVIDs。

2.5 用ELISA法检测NT-proBNP、cTn-T和CK含量[7]7]

采集各组实验大鼠血液5 mL,离心后，取上清液，备用。在96孔板中，分别加入不同浓度标准品稀释液每孔50 μL后，加入血清每孔50 μL、工作液A每孔50 μL,摇匀后，加盖覆膜，孵育；弃去孔内液，加入洗涤液每孔350 μL,用滤纸拍干；分别加工作液B每孔100 μL、底物溶液每孔90 μL后，恒温箱孵育；每孔加入终止液50 μL,并在混合后立即测量光密度(optical density, OD)值；根据绘制的标准曲线计算样品中NT-proBNP、cTn-T、CK含量。

2.6 用HE染色法和Masson染色法检测心肌组织的病理变化

HE染色：心肌组织切片厚度为5 μm; 二甲苯透明，梯度乙醇浸泡；苏木精5 min, 盐酸溶液分化3 s, 伊红3 min; 放入梯度乙醇各3 min, 二甲苯透明10 min, 封片。Masson染色：切片脱蜡水化(与HE染色相同);苏木精染色5 min, 丽春红染色5 min, 磷钼酸处理3 min, 苯胺蓝复染5 min, 最后进行脱水封片。

2.7 用蛋白质印迹法检测心肌组织中相关蛋白的表达水平[8]8]

用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide Gel electropheresis, SDS-PAGE)制备试剂盒，电泳至溴酚蓝里最底部约1 cm即可终止电泳；100%甲醇激活PVDF膜2 min; 300 mA恒流30 min, 冰中进行；TBST洗1次，加入5%脱脂牛奶，放于脱色摇床上，室温30 min; 按说明书稀释一抗，4 ℃过夜，TBST洗4遍×每次5 min, 摇床上二抗室温孵育1 h; 重复TBST洗4遍，加入ECL发光液，曝光，保存原始图。

3 统计学处理

用SPSS 20.0软件进行统计分析。实验数据用x¯±s

表示，组间比较用单因素方差分析法(LSD-ANOVA)。

二、结果

1 5组大鼠超声心动图的比较

低、中、高剂量实验组分别给予1.46、2.92、5.84 g·kg-1参丹方溶液；正常组和模型组均给予等量0.9%NaCl。

心脏超声检测结果显示：与正常组比较，模型组大鼠的LVIDd和LVIDs均显著升高，LVEF和FS均显著下降，差异均有统计学意义(均P<0.01);与模型组相比，低、中、高剂量实验组的LVEF和FS均显著升高，中、高剂量实验组的LVIDd和LVIDs均显著降低，差异均有统计学意义(均P<0.01)。结果见表1。

2 5组大鼠血清NT-proBNP、CK和cTn-T水平的比较

ELISA法检测结果显示：与正常组相比，模型组大鼠血清NT-proBNP、CK和cTn-T水平均显著升高，差异均有统计学意义(均P<0.01);与模型组相比，低、中、高剂量实验组大鼠血清NT-proBNP、CK和cTn-T水平均有不同程度的降低，差异均有统计学意义(均P<0.01),尤以高剂量实验组最为显著。结果见表2。

3 5组大鼠心肌组织的病理改变

HE染色结果显示：正常组心肌组织形态、结构正常，细胞核居中，心肌纤维排列整齐，未见明显的组织学改变；模型组心肌组织受损，心肌细胞肥大，细胞核变形甚至消失，心肌纤维断裂，细胞间隙增宽；与模型组相比，低、中、高剂量实验组病变区域及心肌纤维化明显逐渐好转，心肌细胞排列逐渐整齐。结果见图1。

Masson染色结果显示：正常组可见绝大部分为正常心肌组织，有少许胶原纤维；模型组可见大量的蓝色胶原纤维，将心肌组织分隔成块状，血管周围细胞外基质增多；低、中、高剂量实验组可见胶原纤维区域逐渐变小，肌纤维排列逐渐整齐，心肌纤维化逐渐减低。结果见图1。

4 5组大鼠心肌组织中PI3K、AKT、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白表达的比较

蛋白质印迹实验结果显示：与模型组比较，中、高剂量实验组大鼠心肌组织中PI3K、AKT、Bcl-2及Bcl-2/Bax蛋白相对表达水平均显著上升，caspase-3、caspase-9和Bax蛋白相对表达水平均显著下降，差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01);模型组的上述指标与正常组比较，差异均有统计学意义(均P<0.01),结果见表3和图2。

表1 5组大鼠心脏超声检测结果的比较(x¯±s)

表2 5组大鼠血清N末端脑钠肽前体(NT-proBNP)、肌钙蛋白T(cTn-T)和肌酸激酶(CK)水平图 1 5组大鼠心肌组织的苏木精-伊红染色(Ⅰ)和Masson染色(Ⅱ)结果(×200)

表3 5组大鼠心肌组织磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、胱天蛋白酶-3(caspase-3)和caspase-9蛋白表达水平的比较图 2 5组大鼠心肌组织中PI3K、AKT、Bcl-2、Bax、caspase-3和caspase-9蛋白的表达情况

三、讨论

DCM的发病机制复杂，且治疗效果并不理想。参丹方可明显改善DCM晚期患者的心悸、水肿、喘憋、短气等症状，尤适用于DCM晚期水肿胀满之症，具有益气活血、温经通脉、利水消肿之功效。

在正常情况下，PI3K/AKT信号通路的激活对心肌细胞的生长和代谢具有重要的调节作用，可促进心肌细胞的存活以及心肌细胞的葡萄糖摄取和氧化代谢，从而提高心肌细胞的能量供应，维持正常的结构和功能[9,10]。本实验研究表明，阿霉素可显著降低心肌组织中PI3K/AKT蛋白表达，而给予参丹方干预后，能够激活PI3K/AKT蛋白表达，从而起到保护心肌的作用。凋亡是由caspases编排的，caspases-3是检测细胞凋亡的可靠标志物[11]。同时，细胞凋亡的内在途径受到Bcl-2蛋白家族的严格调控。促凋亡的Bax可以通过渗透线粒体外膜并随后启动半胱天冬酶级联，使细胞发生程序性死亡[12]。因此，Bax的活性受到Bcl-2家族内外复杂蛋白网络的精确控制。本研究结果发现，参丹方能通过激活PI3K/AKT信号通路使Bax、caspase-3、caspase-9蛋白表达水平均显著降低，说明参丹方能通过调控PI3K/AKT发挥抗心肌细胞凋亡作用，有望成为新的治疗DCM的有效中药复方。亦有研究发现，运用益气活血温阳利水法治疗DCM效果十分确切，可有效改善患者的临床症状与心肌功能，提高患者的生活质量，且临床用药安全能够得到有效保障[13],这与本研究结果相似。

参考文献:

[2]李靖,李荣.扩张型心肌病与中医“心胀”关系的研究进展[J].中西医结合心脑血管病杂志,2020,18(18):3010-3011.

[3]伍瑶,范金茹,代璐.范金茹论扩张型心肌病中医病名､病因病机及证治[J].中医药通报,2019,18(6):19-21.

[4]谭雨晴,李颖,李军.中医药治疗扩张型心肌病的临床研究现状[J].中华中医药杂志,2019,34(8):3655-3657.

[13]杨凤鸣,曾垂义.益气活血温阳利水法治疗扩张型心肌病合并心力衰竭的临床疗效探讨[J].医药论坛杂志,2022,43(21):91-94.

基金资助:国家中医药管理局中医药科学技术研究专项基金资助项目(GZY-KJS-2021-004);陕西省中医药管理局中西医结合临床协同创新基金资助项目(2020-ZXY-001);

文章来源:陈伟佳,白烨升,祁玉营等.参丹方通过PI3K/AKT信号通路改善扩张型心肌病大鼠心肌细胞凋亡的研究[J].中国临床药理学杂志,2023,39(21):3116-3120.