首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 药学论文 > 中药学论文 > 茶多酚对甲基苯丙胺诱导的PC12细胞神经元损伤研究

茶多酚对甲基苯丙胺诱导的PC12细胞神经元损伤研究

2023-11-16 95 上传者：管理员

摘要：目的研究茶多酚在甲基苯丙胺(MPP+)诱导的PC12细胞神经元损伤中的作用机制。方法研究分为对照组、模型组和低、高剂量实验组。对照组在RPMI 1640培养基中培养，模型组在对照组的基础上用MPP+(1 mmol·L-1)处理细胞24 h。低、高剂量实验组在添加MPP+之前分别用10μmol·L-1和20μmol·L-1的茶多酚预处理1 h。观察各组细胞形态变化，以细胞计数法-8(CCK-8)检测细胞活力，用流式细胞术检测细胞凋亡情况，检测活性氧(ROS)表达水平，用Comet assay分析各组细胞DNA损伤情况，用蛋白质印迹法检测DNA修复相关蛋白表达水平。结果通过CCK-8实验和细胞形态学观察，发现模型组的细胞增殖率为0.36±0.02,而低、高剂量实验组的细胞增殖率为0.55±0.02、0.67±0.03,表明茶多酚可显著减轻MPP+对PC12细胞的细胞毒性和形态损伤。进一步的实验表明，茶多酚可以降低MPP+诱导的氧化应激程度，增强细胞内抗氧化能力，对照组、模型组和低、高剂量实验组的ROS水平分别为(14.36±1.34)%、(32.64±3.72)%、(21.64±2.08)%和(18.45±1.66)%,结果表明与对照组相比，模型组的ROS水平显著升高(P<0.05),而低、高剂量实验组组的ROS水平显著低于模型组(P<0.05),从而减轻氧化应激对细胞的损伤。此外，茶多酚还能够促进细胞DNA修复功能的活化，对照组、模型组和低、高剂量实验组的γ-H2AX水平分别为1.00±0.08、1.82±0.13、1.35±0.09和1.22±0.07;Ku70水平分别为1.00±0.10、0.49±0.06、0.82±0.08和0.98±0.10;XRCC1水平分别为1.00±0.11、0.51±0.06、0.90±0.09和1.15±0.12;与对照组相比，模型组γ-H2AX表达显著增加，Ku70和XRCC1的表达降低。低、高剂量实验组Ku70和XRCC1的表达显著增高，从而改善MPP+对细胞DNA的损伤。结论茶多酚可以通过减少氧化应激和促进DNA修复来保护PC12细胞免受MPP+诱导的神经毒性。

关键词：
DNA修复
PC12细胞
氧化应激
甲基苯丙胺
茶多酚
加入收藏

甲基苯基吡啶鎓离子(methylphenylpyridinium ion, MPP+)是一种神经毒素，与帕金森病(Parkinson’s disease, PD)的发病机制有关[1]。PC12 细胞经诱导分化后具有神经细胞特性，是一种研究中常用的神经细胞系[2]。PC12细胞通常用于研究神经元功能和毒性物质对神经元的影响[3]。MPP+引起的氧化应激和DNA损伤被认为是帕金森病神经退行性变的重要机制[4]。茶多酚已被证明具有抗氧化特性，并被认为在神经退行性疾病中具有神经保护作用[5]。茶多酚作为一种天然的抗氧化剂，在预防和治疗神经系统疾病方面具有重要的作用。茶多酚在疾病防治中主要是通过减轻氧化应激和促进DNA修复来发挥神经保护作用[6]。本研究旨在探讨茶多酚在减少MPP+诱导的PC12细胞损伤中的作用机制。

一、材料与方法

1 材料

细胞PC12细胞，购自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所。

药品与试剂茶多酚，规格：每支25 000 units, 纯度：98%,批号：Mfcd00082118,美国Sigma-Aldrich公司生产。MPP+,美国Sigma-Aldrich生产；细胞增殖及毒性检测试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)试剂盒和活性氧(reactive oxygen species, ROS)检测试剂盒检测试剂盒，均购自上海Beyotime公司；彗星检测试剂盒，购自艾博抗(上海)贸易有限公司；抗γ-H2A组蛋白家族成员X(γ-H2A histone family member X,γ-H2AX)、Ku抗原70 kDa亚基(Ku antigen 70 kDa subunit, Ku70)和X射线修复交叉互补基因1(X-ray repair cross-complementing gene 1,XRCC1)的一级抗体，均购自美国细胞信号技术公司；超敏电化学发光(enhanced chemiluminescent, ECL)检测试剂盒，购自美国GE Healthcare公司；洛斯维·帕克纪念研究所(Roswell Park Memorial Institute, RPMI) 1640培养基和预冷的磷酸盐缓冲液，均购自武汉赛维尔生物科技有限公司。

仪器Steri-Cycle i160 CO2培养箱，美国Thermo Fisher Scientific产品；FACSCanto流式细胞仪，美国BD Biosciences公司产品；DP70荧光显微镜，日本Olympus Corporation公司产品。

2 实验方法

2.1 细胞培养与分组

细胞在含有10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)和1%抗生素抗真菌溶液的RPMI 1640培养基中培养。细胞在37 ℃下保持在含有5%CO2的湿润气氛中。将细胞分为对照组、模型组、低剂量实验组和高剂量实验组。对照组常规培养，模型组和低、高剂量实验组用MPP+(1 mmol·L-1)处理细胞24 h。低、高剂量实验组在添加MPP+之前，分别用10 μmol·L-1和20 μmol·L-1的茶多酚预处理1 h。

2.2 以荧光显微镜观察细胞形态

各组细胞处理24 h后，用荧光显微镜观察细胞，分析并拍摄细胞形态的变化。

2.3 以CCK-8法检测细胞活力[7]7]

以每孔1×105个细胞的密度将细胞接种在96孔板中，置细胞培养箱(37 ℃、5% CO2)培养24 h, 取出培养板，去除上清液，细胞分组处理24 h, 再次去除上清液，每孔加入CCK-8溶液10 μL和新鲜完全培养基100 μL并孵育4 h。用微孔板读取器在450 nm处测量每个孔的光密度值。

2.4 以流式细胞术检测细胞凋亡[8]8]

将细胞接种在6孔板中，细胞分组处理24 h, 用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline, PBS)洗涤，并用膜联蛋白V-FITC和PI染色，然后用流式细胞仪对细胞凋亡情况进行分析。

2.5 以ROS试剂盒检测ROS水平[9]9]

将细胞接种在6孔板中，细胞分组处理24 h, 用预冷的PBS洗涤，并用DCFH-DA染色，然后用ROS试剂盒检测ROS水平。

2.6 以彗星试验检测DNA损伤[10]10]

将细胞接种在6孔板中，细胞分组处理24 h, 并与低熔点琼脂糖混合，对细胞进行电泳并用溴化乙锭染色，用荧光显微镜观察染色的细胞，并用Comet assay软件进行分析。

2.7 以蛋白质印迹法检测γ-H2AX、Ku70和XRCC1的表达[11]11]

将细胞接种在6孔板中，细胞分组处理24 h, 然后收获每组细胞并用RIPA缓冲液裂解。用Bradford方法测定蛋白质浓度。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离等量的蛋白质，取出凝胶，甲醇放入聚偏氟乙烯膜放置5～10 s, 加进转膜液，转膜槽进行冰浴，使蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜上。用抗γ-H2AX、Ku70和XRCC1的一级抗体探测，然后用二级抗体探测。用ECL检测试剂盒检测蛋白质条带，并用Image J软件进行分析。

3 统计学处理

实验数据用SPSS 22.0进行统计分析。根据Shapiro-Wilk正态分布检验判断数据是否符合正态分布，根据方差齐性检验判断数据方差是否齐性，用双因素方差分析(ANOVA)进行比较。

二、结果

1 茶多酚对MPP+诱导PC12细胞损伤的影响

对照组常规培养，模型组用MPP+(1 mmol·L-1)处理细胞24 h; 低、高剂量实验组在添加MPP+之前，分别用10 μmol·L-1和20 μmol·L-1的茶多酚预处理1 h。

在用MPP+处理24 h后，模型组细胞的形态发生了显著改变，一些细胞显示出收缩和碎裂的迹象，而对照组和低、高剂量实验组的细胞保持健康和正常。与对照组相比，模型组的细胞活力显著降低(P<0.05),而低、高剂量实验组的细胞活力显著高于模型组(P<0.05),见表1。

2 茶多酚减少MPP+诱导的细胞凋亡

研究结果表明，模型组的凋亡细胞比例显著高于对照组(P<0.05),而低、高剂量实验组的细胞比例显著低于模型组(P<0.05),见表1。

3 茶多酚降低氧化应激水平

结果显示：与对照组相比，模型组的ROS水平显著升高(P<0.05),而低、高剂量实验组的ROS水平显著低于模型组(P<0.05),见表1。

表1 不同剂量茶多酚对细胞活力、活性氧水平和DNA损伤的影响(x¯±s)

4 茶多酚减少MPP+诱导的DNA损伤

与对照组相比，模型组PC12细胞中DNA损伤程度显著升高(P<0.05)。与模型组相比，低、高剂量实验组的细胞DNA损伤程度显著降低(P<0.05),见表1。

5 茶多酚上调DNA损伤修复相关蛋白

与对照组相比，模型组γ-H2AX的表达显著增加，Ku70和XRCC1的表达降低(P<0.05)。与模型组相比，低、高剂量实验组Ku70和XRCC1的表达显著增高，提示茶多酚通过提高Ku70和XRCC1的表达水平，进而抑制细胞凋亡，见图1和表2。

图1 茶多酚对DNA损伤修复相关蛋白标的影响

表2 茶多酚对DNA修复相关蛋白表达的影响(x¯±s)

三、讨论

茶多酚是一种天然的抗氧化剂，被广泛认为具有多种生物活性作用，包括抗氧化、抗癌、减轻炎症等[12]。有研究表明，茶多酚能够降低细胞的氧化应激水平，进而减少细胞凋亡[13]。甲基苯丙胺是一种常见的神经毒素，已被证实能够导致神经元的氧化应激和DNA损伤，从而导致神经元的损伤和死亡。本研究证明了茶多酚通过减轻氧化应激和促进DNA修复来减轻甲基苯丙胺诱导的PC12细胞神经元损伤。本研究结果表明，茶多酚可以减少MPP+诱导的氧化应激和DNA损伤，并促进DNA修复相关蛋白的表达。

先前的研究表明，MPP+诱导的神经毒性与氧化应激和DNA损伤有关[14,15]。ROS被认为是MPP+诱导的神经元细胞死亡的关键介质之一[16]。氧化应激是神经退行性疾病中常见的病理过程，可以导致神经元损伤和死亡。茶多酚具有强大的抗氧化能力，可以中和自由基生成并抑制氧化反应，从而保护神经细胞免受氧化应激的损伤。本研究结果表明，茶多酚可以降低MPP+处理的PC12细胞中的ROS水平并降低氧化应激。

DNA修复是细胞维持正常功能的重要过程，损伤DNA会导致细胞死亡或异常增殖[17]。茶多酚可以通过增加DNA修复相关基因的表达来促进DNA修复，从而降低细胞死亡的风险。DNA损伤是MPP+神经毒性作用的另一个潜在机制。DNA损伤作为细胞凋亡的一大影响因素，在MPP诱导的神经元细胞中具有显著作用[18]。彗星试验结果表明，茶多酚可以显著减少MPP+诱导的PC12细胞DNA损伤。受损DNA的修复高度依赖于DNA修复相关蛋白的活性，如γ-H2AX、Ku70和XRCC1。目前研究表明，γ-H2AX是表征DNA损伤的特异性生物标志物，可作为基因毒性的特异性效应指标[19]。本研究发现，茶多酚可以上调Ku70和XRCC1的表达，降低γ-H2AX的表达，这表明茶多酚可以促进MPP+处理的PC12细胞的DNA修复。

本研究结果表明，茶多酚可以通过减少氧化应激和促进DNA修复来保护PC12细胞免受MPP+诱导的神经毒性。

参考文献:

[1]黄晓静,黄淮,徐正虎,等.黄芪甲苷改善1-甲基-4-苯基吡啶离子诱导的帕金森病SK-N-SH细胞损伤疗效初探[J].中国现代神经疾病杂志,2022,22(3):155-162.

[2]蔡瑶,曹彬彬,袁燕,等.穿心莲内酯抑制镉诱导的PC12细胞凋亡[J].畜牧与兽医,2022,54(8):110-114.

[3]周密,陆瑶,刘惠霞,等.鸢尾甲苷B对氧糖剥夺/复氧损伤PC12细胞的神经保护作用[J].长春师范大学学报,2022,41(6):84-89.

[4]马媛媛,周畅,陈枫蕾,等.4-氨基吡啶对MPP~+诱导帕金森病细胞具有神经保护作用[J].中国现代医生,2023,61(1):31-34.

[5]蔡飞,李彩蓉,吴基良,等.茶黄素对大鼠脑缺血再灌注损伤后细胞凋亡及凋亡相关基因的影响[J].时珍国医国药,2008,154(6):1396-1398.

[6]李梅,尚宇梅,王智慧,等.茶多酚与神经退行性疾病的研究进展[J].中国中医基础医学志,2019,25(11):1631-1634.

[7]陈金锐,李红,于音.菊苣酸通过磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路抑制口腔癌KB细胞增殖､侵袭与黏附的研究[J].中国临床药理学杂志,2022,38(11):1199-1202.

[8]喻伟,李丽.谷氨酰胺对脂多糖诱导结肠上皮细胞炎症损伤的保护作用[J].中国临床药理学杂志,2022,38(10):1074-1077,1082.

[9]杨宽,刘进进,安晋阳,等.核因子E2相关因子2/抗氧化反应元件信号通路在H2O2致MC3T3-E1细胞成骨分化损伤中的研究[J].中国临床药理学杂志,2023,39(6):853-858.

[10]崔丽娟,张娟,程宇,等.彗星实验方法学的改进用于DNA损伤检测[J].临床和实验医志,2018,17(14):1480-1484.