山楂叶是蔷薇科植物山里红Crataegus pinnatifida Bge.var.major N.E.Br或山楂Crataegus pinnatifida Bge.的干燥叶，味酸，性平，归肝经，主治气滞血瘀、高脂血症、胸痹心痛、心悸健忘等[1],主要化学成分为黄酮类、三萜类等[2]。现代研究表明，山楂叶对保护心血管系统，增加冠脉血流量、降血糖以及抗氧化、抗炎等均有一定作用[3,4,5,6,7,8]。

中药饮片标准汤剂是以中医理论为指导，临床应用为基础，参考现代提取方法并经标准化工艺制备而成的单味中药饮片水煎剂[9]。《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》规定，由于中药饮片药性、功效、质地、吸水性有较大差异，在制备标准汤剂时应对浸泡时间、加水量、煎煮时间等工艺参数进行优化[10]。目前，有关山楂叶标准汤剂制备工艺的研究较少，故本实验采用层次分析法结合响应面法对其进行优化，以期为该制剂功能成分研究提供科学依据和技术参考。

1、材料

1.1 仪器

Agilent1200型高效液相色谱仪(美国Agilent公司);UV-2600 PROBE型紫外-可见分光光度计(日本岛津公司);KQ-700型双频数控超声波清洗器(40 kHz, 昆山市超声仪器有限公司);AG-245型电子分析天平(十万分之一，瑞士梅特勒-托利多公司);JA5003型上皿天平(千分之一，天津天马衡基仪器有限公司)。

1.2 试剂与药物

芦丁(批号181227)、牡荆素葡萄糖苷 (批号20042350)、牡荆素鼠李糖苷(批号18060103)、金丝桃苷 (批号19103001)、异槲皮素 (批号18062702)对照品均购于成都普菲德生物技术有限公司(纯度>98%)。山楂叶(产地河北省承德市隆化县)购于市场，经全国老中医药专家(传统鉴定)学术经验继承人孙宝惠主任药师鉴定蔷薇科山楂属植物山楂Crataegus pinnatifida Bunge的叶。乙腈、甲酸、甲醇为色谱纯，购于美国Thermo Fisher Scientific公司；其他试剂均为分析纯；水为纯净水，购于天津娃哈哈饮料有限公司。

2、方法与结果

2.1 出膏率测定

将山楂叶水煎液减压浓缩至250 mL,精密量取10 mL至恒重升温干燥皿中，70 ℃水浴蒸干(约3 h),置于60 ℃烘箱中干燥5 h, 称定质量，计算出膏率[11],公式为出膏率=[25×(m2-m1)/M]×100%,其中m1为蒸发前升温干燥皿质量，m2为烘干至恒重后升温干燥皿质量，M为山楂叶质量。

2.2 总黄酮提取率测定

2.2.1 对照品溶液制备

精密称取120 ℃下干燥至恒重的芦丁对照品15.58 mg, 转移至50 mL量瓶中，加60%甲醇超声处理至完全溶解，定容至刻度，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液制备

将山楂叶水煎液减压浓缩至250 mL,精密量取5 mL,转移至50 mL量瓶中，加60%甲醇混匀并定容至刻度，过0.45 μm微孔滤膜，精密量取续滤液10 mL,转移至25 mL量瓶中，60%甲醇定容至刻度，即得。

2.2.3 线性关系考察

按照文献[12]报道，以总黄酮质量浓度为横坐标(X),吸光度为纵坐标(A)进行回归，得方程为A=0.012 6X-0.021 4(r=0.999 2),在12.464～74.784 μg/mL范围内线性关系良好。

2.2.4 测定方法

按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，取1 mL至25 mL量瓶中，按“2.2.3”项下方法测定吸光度，计算提取率，公式为提取率=(C×15.625/M)×100%,其中C为总黄酮质量浓度，M为山楂叶质量。

2.3 各成分总提取率测定

采用HPLC法。

2.3.1 色谱条件

Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm);流动相(乙腈-四氢呋喃，12∶1)(A)-0.3%甲酸(B),梯度洗脱(0～15 min, 8%～12%A;15～25 min, 12%～16%A;25～37.5 min, 16%～15%A;37.5～45 min, 15%～20%A;45～50 min, 20%～34%A;50～55 min, 34%～100%A);体积流量1.0 mL/min; 柱温30 ℃;检测波长350 nm; 进样量10 μL。色谱图见图1。

图1 各成分HPLC色谱图   

2.3.2 对照品溶液制备

精密称取牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、金丝桃苷、异槲皮素对照品适量，60%甲醇制成质量浓度分别为204.0、300.0、131.82、61.98 μg/mL的贮备液，精密吸取适量，60%甲醇依次稀释至2、4、8、16、32、64倍，即得。

2.3.3 供试品溶液制备及测定方法

将山楂叶水煎液减压浓缩至250 mL,精密量取5 mL,转移至50 mL量瓶中，加60%甲醇混匀并定容至刻度，0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定，计算提取率，公式为提取率=[C1×A2/(4×A1×M)]×100%,其中C1为对照品质量浓度，A1为对照品峰面积，A2为供试品峰面积，M为山楂叶质量。

2.3.4 线性关系考察

精密吸取“2.3.2”项下对照品溶液10 μL,在“2.3.1”项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y)进行回归，结果见表1,可知各成分在各自范围内线性关系良好。

2.3.5 精密度试验

取同一份供试品溶液，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定6次，测得牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、金丝桃苷、异槲皮素峰面积RSD分别为0.53%、0.33%、1.44%、0.58%,表明仪器精密度良好。

2.3.6 重复性试验

取同一批标准汤剂，按“2.3.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定，测得牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、金丝桃苷、异槲皮素含量分别为0.50%、0.47%、1.45%、0.74%,表明该方法重复性良好。

表1 各成分线性关系

2.3.7 稳定性试验

取同一份供试品溶液，于0、2、4、8、12、24 h在“2.3.1”项色谱条件下进样测定，测得牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、金丝桃苷、异槲皮素峰面积RSD分别为0.91%、0.70%、2.28%、2.00%,表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.8 加样回收率试验

精密吸取各成分含量已知的标准汤剂浓缩液2.5 mL,共6份，按100%水平精密加入对照品溶液，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、金丝桃苷、异槲皮素平均加样回收率分别为102.72%、95.70%、98.61%、97.19%,RSD分别为0.51%、0.10%、0.64%、0.47%。

2.4 层次分析法

2.4.1 判断矩阵构建

总黄酮是山楂叶主要活性成分，2020年版《中国药典》也将该成分含量作为山楂叶及其提取物的主要质量控制指标[1,12],故本实验将其提取率作为第一重要测定指标；牡荆素鼠李糖苷、金丝桃苷在山楂叶中的含量较高，2020年版《中国药典》也将两者分别作为山楂叶提取物、药材的质量控制指标[1,12],故本实验将其提取率作为第二重要测定指标；牡荆素葡萄糖苷、异槲皮素在山楂叶中的含量也较高，药理活性明确，在相关质量控制研究中常作为定性定量指标[13,14,15,16,17],但尚未被2020年版《中国药典》收录，故本实验将两者提取率作为第三重要测定指标；出膏率是用于判断制备工艺稳定性的重要指标，但不能反映有效成分质量信息，故本实验将其作为第四重要测定指标。按总黄酮提取率>牡荆素鼠李糖苷提取率=金丝桃苷提取率>牡荆素葡萄糖苷提取率=异槲皮素提取率>出膏率的顺序，根据层次分析法理论判断矩阵1～9标度法[18],对同一层次内其相对重要程度进行打分，其中总黄酮作为山楂叶主要活性成分，其提取率相对于出膏率强烈重要，故标为7;牡荆素鼠李糖苷、金丝桃苷提取率相对于出膏率明显重要，故标为5;牡荆素葡萄糖苷、异槲皮素提取率相对于出膏率稍重要，故标为3,以此类推，构建判断矩阵，见表2。

2.4.2 权重计算

先构建几何平均判断矩阵M,依据公式(1)计算初始权重系数 Wj′,其中ajn表示表示第j(j=1,2,…,n)个指标因素对第n(n=1,2,…,j)个指标因素的比较结果，再依据公式(2)计算归一化权重系数 WjS,得到6个指标权重系数分别为0.041 67、0.291 67、0.208 33、0.208 33、0.125、0.125。

表2 指标成对比较的优先判断矩阵

2.4.3 一致性检验

对矩阵进行一致性检验，计算一致性指标(CI)、一致性比例(CR)。根据公式(3)～(5)测得CI=0,CR=0,均小于0.1,表明该矩阵一致性良好。

λmax=[∑nj=1(∑nj=1ajnW′j/W′j)]/n         (3)CI=(λmax−n)/(n−1) (4)CR=CI/RI         (5)

2.4.4 综合评分

通过层次分析法对标准汤剂各指标权重进行量化，计算综合评分Y,公式为Y=总黄酮提取率×0.291 67+鼠李糖苷提取率×0.208 33+金丝桃苷提取率×0.208 33+葡萄糖苷提取率×0.125+异槲皮素提取率×0.125+出膏率×0.041 67。

2.5 单因素试验

2.5.1 浸泡时间

前期报道，充分浸泡可使中药饮片表面湿润变软，即植物细胞吸水膨胀，吸水率越高，膨胀越充分，植物细胞内活性成分在煎煮过程中更易溶出[19],公式为吸水率=(V药材吸水量/V加水总量)×100%。取山楂叶100 g, 加14倍量水，分别考察浸泡时间10、20、30、40、50 min对吸水率的影响，发现各时间点吸水率分别为0.161%、0.196%、0.200%、0.204%、0.204%,即随着浸泡时间延长吸水率升高，而浸泡40 min后无变化，故确定浸泡时间为40 min。

2.5.2 加水量

取山楂叶100 g, 浸泡40 min, 根据2021年发布的《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》[10](标准汤剂每剂药一般煎煮2次，加水量一般以浸过药面2～5 cm为宜),药材煎煮2次，一煎30 min, 二煎20 min, 趁热过滤，合并2次滤液，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，分别考察加水量(10+8)、(12+10)、(14+12)、(16+14)、(18+16)倍对综合评分的影响，发现不同加水量下综合评分分别为3.140、3.532、3.817、3.820、3.789分，即在一煎加14倍量水、二煎加12倍量水时综合评分趋于平缓，可能已接近最大溶解量，故确定加水量为一煎14倍，二煎12倍。

2.5.3 煎煮时间

取山楂叶100 g, 浸泡40 min, 加水量为一煎14倍，二煎12倍，趁热过滤，合并2次煎煮液，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，根据2021年发布的《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》[10](煎煮时间为20～60 min, 并且第二煎时间可适当缩短),考察煎煮时间(20+20)、(30+20)、(40+30)、(50+40)、(60+50)min对综合评分的影响，发现不同煎煮时间下综合评分分别为3.526、3.670、3.854、3.917、3.954分，即煎煮(50+40)min后趋于平缓，故确定煎煮时间为一煎50 min, 二煎40 min。

2.6 Box-Behnken响应面法

在单因素试验基础上，选择浸泡时间(A)、加水量(B)、煎煮时间(C)作为影响因素，总黄酮、牡荆素鼠李糖苷、金丝桃苷、牡荆素葡萄糖苷、异槲皮素提取率及出膏率的综合评分(Y)作为评价指标，采用Design-Expert 12.0软件优化制备工艺，因素水平见表3,结果见表4。

表3 因素水平

采用上述软件对表4数据进行多元回归拟合，得方程为Y=3.82+0.001 3A+0.293 8B-0.047 5C-0.025AB+0.022 5AC+0.142 5BC+0.016A2-0.139B2-0.081 5C2,方差分析见表5。由此可知，模型F=33.34,P<0.000 1,具有高度显著性；失拟项F=2.90,P=0.165 2>0.05,表明结果受未知因素的干扰较小，残差由随机误差引起；决定系数R2=0.977 2,校正决定系数R2adj=0.947 9,变异系数CV为1.48%,表明模型置信度较高，可用于预测分析；因素B、C、BC、B2、C2有显著或极显著影响(P<0.05,P<0.01);各因素影响程度依次为B>C>A。

响应面分析见图2～4。最终确定，最优工艺为浸泡时间30 min, 一煎加16倍量水煎煮54.44 min, 二煎加14倍量水煎煮44.44 min, 综合评分为4.029分，根据实际操作的可行性，将其修正为浸泡时间30 min, 一煎加16倍量水煎煮55 min, 二煎加14倍量水煎煮45 min。按上述优化工艺进行3批验证试验，测得综合评分分别为4.07、4.09、4.05分，平均4.07分，RSD为0.49%,与预测值4.029分接近(相对偏差为1.01%),表明该工艺稳定、准确、可靠。

表4 试验设计与结果

表5 方差分析

图2 浸泡时间、加水量对综合评分的影响   

图3 浸泡时间、煎煮时间对综合评分的影响   

图4 加水量、煎煮时间对综合评分的影响   

3、讨论与结论

响应面法结果显示，浸泡时间30、40、50 min对山楂叶标准汤剂制备工艺无明显影响，结合单因素试验推测，可能是由于浸泡30 min时药材吸水率为0.196%,已接近最大值0.204%,即植物细胞已达到充分溶胀，故从降低制备成本、节约时间、提高效率的角度出发，确定最优浸泡时间为30 min。

2020年版《中国药典》项下山楂叶成分检测指标仅有总黄酮、金丝桃苷含量，但中药为多组分的复杂体系，仅测定这2种成分含量难以全面评价该部位及其相关制剂质量。山楂叶主要有效成分为黄酮，包括牡荆素鼠李糖苷、金丝桃苷、牡荆素葡萄糖苷、异槲皮素等，具有抗动脉粥样硬化、抗氧化、降血糖等作用[20,21,22,23],本实验采用层次分析法结合响应面法优化其标准汤剂制备工艺，对比《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》[10]规定，可使结果更科学化，并验证了该工艺的合理性。

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基金资助:河北省省级科技计划资助项目(20372507D);河北省高校重点学科建设项目(冀教高[2013]4号);承德医学院自然科学研究计划青年基金项目(202309);承德医学院中药药效物质基础青年PI科技创新团队资助(2022);

文章来源:杜义龙,高静云,刘文通等.山楂叶标准汤剂制备工艺优化[J].中成药,2023,45(11):3724-3728.