干扰素诱导跨膜蛋白(interferon-inducible transmembrane proteins, IFITMs)基因家族是Chen Y X等于1984年通过cDNA文库筛选首次发现的[1],这些蛋白是目前发现唯一能在病毒进入阶段抑制病毒感染和增殖的宿主限制因子(host restriction factors, HRFs)。2009年，Brass A L 等研究报道IFITMs在甲型流感病毒(Influenza A virus, IAV)感染早期能显著抑制病毒复制[2],使人们对该家族成员的抗病毒活性有了全新的认识和更深刻的理解。IFITM家族包含IFITM1、IFITM2、IFITM3、IFITM5、IFITM6、IFITM7、IFITM10以及一些类IFITM。研究发现，IFITM1、IFITM2和IFITM3对甲型流感病毒、西尼罗病毒、登革病毒、丝状病毒、丙型肝炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、基孔肯雅病毒、水疱性口炎病毒甚至SARS冠状病毒等均具有广泛的抗病毒活性，其中，IFITM3在抑制病毒入侵中占主导地位[3,4,5]。IFITM5主要与脊椎动物的骨骼发育有关；IFITM6参与抑制肿瘤组织中巨噬细胞的功能；到目前为止，还没有关于IFITM7和IFITM10功能的报道。IFITM家族同源基因存在于许多其他物种中，如有袋类、鸟类、鱼类和爬行类动物，提示IFITMs具有重要的作用[6]。

已经发现的猪IFITMs (swine IFITMs, SwIFITMs) 有5个，分别为SwIFITM1、2、3、5和10。SwIFITM1有两个N端和C端不同的同源体，分别命名为SwIFITM1a和1b[7]。尽管IFITM5主要在成骨细胞中表达，并且是骨矿化必需的，但一项研究发现，小鼠IFITM5不限制IAV,却能有效地抑制丝状病毒进入细胞[8]。关于IFITM10的研究报道很少，对其功能仍不清楚[9]。猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)感染引起的猪繁殖与呼吸综合征(PRRS),是对全球养猪业生产影响最严重的传染性疾病之一。PRRSV感染能抑制宿主细胞中Ⅰ型干扰素(interferon, IFN)的产生，从而逃逸宿主的抗病毒免疫反应[10,11,12,13,14]。Zhang A等研究确定，IFITM3过表达能抑制PRRSV复制，而沉默内源性IFITM3显著促进了PRRSV复制，外源性和内源性IFITM3均能被纳入病毒粒子中，通过产生感染性降低的病毒粒子干扰PRRSV复制[15]。

本研究以干扰素刺激的猪外周血淋巴细胞总RNA为模板，克隆SwIFITM3编码基因，在对序列进行生物信息学分析的基础上采用原核表达系统表达SwIFITM3,并用纯化的目的蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体，同时采用Western blot方法检测了PRRSV感染PAM中SwIFITM3 的表达水平，为进一步研究IFITM3在抗PRRSV等病毒中的作用提供材料与参考。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 载体、病毒、细胞

pColdⅠ载体、PRRSV SD16株(GenBank登录号：JX087437.1),由西北农林科技大学动物重大疫病病原感染与致病机制团队(以下简称本团队)保存；pMD18-T Vector (simple) 为TaKaRa公司产品；E.coli DH5a、BL21(DE3)感受态细胞，购自全式金生物技术有限公司。PRRSV阴性猪PAM由本团队分离保存。

1.1.2 试验用动物

6～8周龄的昆明系小白鼠，体重18～22 g, 购自空军军医大学实验动物中心；28日龄健康PRRSV阴性仔猪，购自杨凌示范区周边某自养猪场。

1.1.3 主要试剂

猪外周血淋巴细胞分离液试剂盒，购自北京索莱宝科技有限公司；依科赛优级胎牛血清(Fetal calf serum, FBS),购自西安易飞生物科技有限公司；RPMI 1640 medium, 为Gibco公司产品；RNAiso Plus、Prime ScriptTM RT reagent kit、Primer STAR Max DNA Polymerase、Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTAR kit、DNA Marker、IPTG,均为TaKaRa公司产品；Anti-His单克隆抗体购自全式金生物技术有限公司产品；HRP标记的羊抗鼠IgG为Cell Signaling Technology产品；Porcine IFN-α,RD公司产品；限制性内切酶、T4 DNA Ligase为NEB公司产品；弗氏佐剂为Sigma公司产品；BCA蛋白定量试剂盒，PageRuler预染蛋白Marker, Thermo Fisher公司产品；其他试剂均为国产分析纯。

1.1.4 主要仪器

电热恒温培养箱(SHI9050B),上海精宏试验设备有限公司产品；高压蒸汽灭菌锅(MLS-3780),SANYO公司产品；生物安全柜(Thermo Scientific 1300),赛默飞世尔科技中国有限公司产品；超纯水仪(Cat.ZR0Q00800),Millipore公司产品；台式高速冷冻离心机(AllegraTM X-22R),BeckMan公司产品；超微量分光光度计(1911008549),BioTek公司产品；电子天平(TE124S),Sartorius公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成

参照GenBank公布的SwIFITM3(GenBank登录号：JQ315416),用Primer Premier 5软件设计用于扩增猪 IFITM3基因全长的特异性引物，预期扩增产物438 bp, 引物由上海立菲生物技术有限公司合成，用超纯水稀释为10 μmol/L后置-20℃保存备用。

F-sIFITM3:CGGGATCCATGAATTGCGCT- TCCC

R-sIFITM3:CCCAAGCTTCTAGTAGCCTC- TGTAATCCTTTATG

1.2.2 猪外周血淋巴细胞分离、培养、刺激与总RNA提取

无菌采集仔猪前腔静脉血，用猪外周血淋巴细胞分离液试剂盒按说明书分离淋巴细胞，用含10% FBS和双抗的RPMI 1640培养液将细胞浓度调整成1×106个/mL,加入24孔细胞培养板，每孔500 μL,同时加入终浓度为2 μg/L的Porcine IFN-α继续培养24 h后收集细胞，参考RNAiso Plus说明书提取细胞总RNA,用Prime ScriptTM RT reagent kit进行反转录获得cDNA,置-20℃保存备用。

1.2.3 猪IFITM3基因克隆与鉴定

以获得的cDNA为模板，采用PCR扩增编码SwIFITM3基因片段，50 μL反应体系包括cDNA 4 μL,10×buffer 5 μL,Primer STAR Max DNA Polymerase 0.25 μL,F-sIFITM3F和R-sIFITM3各1 μL,dNTP Mixture 4 μL,ddH2O补足至 50 μL;反应条件为：98℃预变性3 min; 98℃变性10 s; 55℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 30个循环；72℃延伸7 min, 4℃保存。扩增产物进行1.5 g/L琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下切取符合预期大小的目的片段回收后进行加A反应，然后与pMD18-T载体连接并转化DH5α 感受态细胞，经氨苄(Amp+)抗性筛选并挑取单菌落培养后进行菌液PCR鉴定，鉴定为阳性的菌液提取质粒进行双酶切和测序鉴定，并对测序结果用DNAStar等生物学软件进行分析。将测序正确的重组质粒命名为pMD18-T-SwIFITM3。

1.2.4 重组表达载体pColdⅠ- SwIFITM3构建与鉴定

用BamHⅠ-HF和HindⅢ-HF分别双酶切pColdⅠ和pMD18-T-SwIFITM3质粒，酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳后回收目的片段，按载体与目的片段摩尔比1∶6过夜连接，经转化、涂板、培养、挑单克隆菌增菌培养，菌液PCR鉴定、提取质粒双酶切鉴定等一系列操作，将鉴定正确的重组载体命名为pColdⅠ-SwIFITM3。

1.2.5 重组SwIFITM3的诱导表达、鉴定与纯化

将重组质粒pColdⅠ-SwIFITM3转入大肠埃希氏菌BL21(DE3)感受态细胞，用IPTG诱导目的蛋白的表达。收集菌体超声裂解后分别制备上清和沉淀样品，与未诱导菌体以及诱导菌体样品进行SDS-PAGE分析，确定目的蛋白是否表达以及表达形式。然后以Anti-His单克隆抗体(1∶5 000稀释)为一抗，以HRP标记的羊抗鼠IgG(1∶10 000稀释)为二抗，ECL显色，对未诱导菌体、诱导菌体、超声后沉淀和上清样品进行Western blot检测。最后大量诱导目的蛋白表达并采用Ni-NTA Resin亲和层析介质对上清中表达的目的蛋白进行纯化，收集纯化的目的蛋白测定浓度后分装并保存于-80℃备用。

1.2.6 多克隆抗体制备与血清抗体效价检测

取纯化的目的蛋白与等量弗氏完全佐剂按1∶1比例乳化后免疫6～8周龄的小鼠，每只小鼠腹腔注射50 μg目的蛋白，两周后将目的蛋白与弗氏不完全佐剂乳化对小鼠进行再次免疫，剂量仍为50 μg, 再2周后采用与再次免疫相同的方法进行第3次免疫。第3次免疫后10 d采血分离血清，采用间接ELISA方法检测血清抗体效价。间接ELISA的包被抗原为纯化的SwIFITM3,剂量为2 ng/孔，4℃包被过夜；用5%脱脂奶粉封闭，免疫小鼠血清和阴性对照血清从1∶2 000开始倍比稀释至1∶2 048 000,每孔加入100 μL,37℃孵育1 h; 二抗为1∶5 000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG,37℃孵育1 h; 底物作用时间15 min, 最后加入50 μL 3 moL/L H2SO4终止反应并测定450 nm吸光度值。

1.2.7 PRRSV感染PAM对SwIFITM3蛋白表达影响检测

冻存的PAM迅速解冻后用含10% FBS的RPMI 1640培养基调整细胞浓度为1×106/mL,每孔2 mL加入6孔细胞板，置37℃、5% CO2培养箱培养6 h后按0.1感染复数(multiplicity of infection, MOI)接种PRRSV SD16株(PRRSV组),同时设不接病毒的对照组。接毒后于37℃、5% CO2培养箱吸附1 h, 然后弃去病毒液并换成含2% FBS的维持液继续培养24 h。收集细胞，参考NP40说明书裂解后制备样品，以制备的SwIFITM3多克隆抗体为一抗(1∶500稀释),HRP标记的羊抗鼠IgG(1∶10 000稀释)为二抗，β-actin作为内参，采用Western blot技术检测SwIFITM3蛋白表达情况。

2、结果

2.1 SwIFITM3基因克隆

以猪外周血淋巴细胞总RNA反转录获得的cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，约438 bp处可见明显扩增条带(图1),结果与预期相符。将扩增产物与pMD18-T Vector连接后筛选阳性质粒进行测序，并与GenBank的中序列进行比对，结果显示获得的编码SwIFITM3的基因长438 bp, 除第384位碱基为“T”,与模板序列的“C”不同外，其余碱基与模板序列完全，但该碱基的差异不影响编码的氨基酸，对应的氨基酸均为Ser(128位)。

2.2 原核表达载体构建

将质粒pMD18-T-SwIFITM3与pCold Ⅰ载体分别双酶切后回收酶切产物过夜连接，用连接产物转化DH5α感受态细胞培养后进行菌液PCR鉴定，提取PCR结果阳性菌液的质粒用BamHⅠ-HF、HindⅢ-HF进行酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳结果显示获得了438 bp的目的片段和4407 bp的载体片段，表明重组表达载体构建成功(图2)。

图1 SwIFITM3 PCR扩增结果   

图2 重组质粒pColdⅠ-SwIFITM3双酶切鉴定  

2.3 猪IFITM3重组蛋白的表达鉴定

将重组质粒pColdⅠ-SwIFITM3转入BL21(DE3)感受态细胞，用IPTG诱导目的蛋白表达，收获菌体超声裂解后分别准备上清和沉淀样品。SDS-PAGE分析显示，目的蛋白主要以可溶性形式存在于上清中，大小约19 ku(图3)。以Anti-His单克隆抗体为一抗采用Western blot检测。结果显示，获得的重组蛋白可以与Anti-His单克隆抗体特异性反应，印迹条带与预期大小一致，未诱导菌样品泳道也呈现微弱的印记条带，说明目的蛋白有本底表达(图4)。

2.4 猪IFITM3重组蛋白的纯化

鉴定后大量诱导目的蛋白表达，然后用Ni-NTA树脂进行纯化，收集样品进行SDS-PAGE分析显示，含200 mmoL/L咪唑的洗脱液能成功洗脱目的蛋白且浓度较高(图5)。用BCA蛋白定量试剂盒检测IFITM3重组蛋白浓度为293.75 μg/mL。

2.5 猪IFITM3多克隆抗体效价检测

小鼠3次免疫后采血分离血清，采用间接ELISA 方法检测发现，免疫的7只小鼠均产生了较好的免疫应答，其中5#小鼠的血清抗体效价最高，达1∶1 024 000(图6)。

图3 猪IFITM3重组蛋白的SDS-PAGE分析   

图4 猪IFITM3重组蛋白的Western blot分析  

图5 SDS-PAGE分析SwIFITM3重组蛋白纯化效果   

2.6 PRRSV感染抑制PAM中IFTIM3蛋白表达

以制备的小鼠抗SwIFITM3多克隆抗体为一抗，采用Western blot技术检测PRRSV感染对PAMs中SwIFITM3蛋白表达的影响，结果显示PRRSV感染几乎完全抑制了PAMs中IFITM3蛋白的表达(图7)。

3、讨论

固有免疫系统是生物体在长期种系进化过程中逐渐形成的天然免疫防御体系，机体固有免疫分子在识别病原体及其产物或体内凋亡、畸变细胞等异物后，能有效清除病原体或体内非己物质。IFITM是目前发现唯一能在病毒进入阶段抑制病毒感染和增殖的宿主限制因子。IFITM家族能发挥抗病毒作用的主要是IFITM1、IFITM2、IFITM3,已有研究表明，IFITM3主要在病毒感染的早期发挥抗病毒作用，在抑制病毒入侵中占主导地位[16]。IFITM3主要定位于细胞的晚期内体和溶酶体，之后在病毒入侵宿主后通过晚期内体和溶酶体途径抑制入侵细胞中病毒的复制[17]。

图6 小鼠血清SwIFITM3抗体效价检测结果   

图7 PRRSV感染抑制PAM中SwIFITM3的表达   

本研究参照GenBank公布的SwIFITM3基因序列，用PrimerPremier 5软件设计特异性引物，以素IFN-α诱导的猪外周血淋巴细胞总RNA为模板，采用RT-PCR技术扩增编码SwIFITM3基因，克隆到pMD18-T Vector ( simple )载体上测序显示，获得的编码SwIFITM3的基因长438 bp, 除第384位碱基为“T”,与模板序列的“C”不同外，其余碱基与模板序列完全，但该碱基的差异不影响编码的氨基酸，对应的氨基酸均为Ser(128位)。然后将目的基因插入原核表达载体pColdⅠ,构建原核表达载体pColdⅠ-SwIFITM3,转入BL21(DE3)感受态细胞，经IPTG诱导，SDS-PAGE和Westerm blot分析表明，获得了预期的目的蛋白，且目的蛋白主要以可溶性形式表达，为后续的纯化提供了方便。用纯化的目的蛋白3次免疫小鼠，采用ELISA方法检测，其中一只免疫小鼠血清抗体效价达1∶1 024 000(图6),高效价多克隆抗体的获得为SwIFITM3的相关研究提供了材料。

对接种猪流感病毒、猪伪狂犬病病毒、PRRSV2或猪圆环病毒14 d猪的气管支气管淋巴结进行基因表达标签谱(Digital gene expression tag profiling, DGETP)分析显示，IFITM家族成员间的基因表达丰度差异显著，贝叶斯框架(Bayesian framework)分析进一步确定了猪IFITM3在整个转录组中为差异表达基因[18]。Zhang A等[15]、温树波等[17]均采用荧光定量RT-PCR检测了PRRSV感染PAM 后IFITM3 mRNA的相对表达，发现IFITM3的转录均呈现先升高后下降的趋势，但这些研究均没有从蛋白水平进行检测。我们以制备的多克隆抗体为一抗，采用Western blot技术检测IFITM3表达时，几乎看不到印记条带，但原核表达的蛋白对照和正常PAM泳道均有预期大小的印迹条带(图7)。说明PRRSV感染虽然导致IFITM3基因转录的短暂增加，但IFITM3蛋白的表达却被抑制了，提示PRRSV感染通过抑制宿主细胞Ⅰ型干扰素(interferon, IFN)的生成进而抑制了干扰素诱导的下游IFITM3的表达，以达到逃逸宿主清除的命运。

参考文献:

[17]温树波,蒙小刚,霍晓伟,等.PRRSV体外感染原代猪肺泡巨噬细胞上调IFITMs分子mRNA转录水平的研究[J].中国病原生物学杂志,2021,16 (8):867-870,877.

基金资助:国家自然科学基金项目(31972675);

文章来源:王慧,郑丹阳,高洁等.猪干扰素诱导跨膜蛋白3的克隆表达及多克隆抗体制备[J].动物医学进展,2023,44(11):14-19.