乳腺增生是一种临床常见病，发病率高。肝郁脾虚是乳腺增生的关键病机之一[1]。研究证实，调节体内雌激素(estrogen, E2)和孕激素(progestational hormone, P)水平能改善患者乳腺增生情况[2]。E2与其受体结合进而调控胞内酶促反应是介导乳腺增生的关键途径。雌激素受体(estrogen receptor, ER)具有非基因组功能，能够通过蛋白质相互作用激活细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)信号通路响应，进而介导细胞增殖反应。国医大师王自立教授临床自创的“归芍运脾汤”[3],为临床治疗肝郁脾虚型乳腺增生的常用方剂。本研究从E2及其受体通路角度探讨归芍运脾汤对肝郁脾虚型乳腺增生大鼠的干预效应及机制。

一、材料与方法

1 材料

动物SPF级SD雌性性成熟大鼠60只，鼠龄12周龄，体质量(180±20)g, 甘肃中医药大学实验动物中心提供。动物许可证号：SCXK(甘)2015-0009。本实验经甘肃中医药大学伦理委员会批准(伦理批号：2021-173)。

药品与试剂党参，批号：A2112353,产地：甘肃，白术，批号：A2071703,产地：浙江，茯苓，批号：A3022103,产地：安徽，当归，批号：A3012053,产地：甘肃，白芍，批号：1105423,产地：安徽，佛手，批号：A3031703,产地：四川，炒麦芽，批号：1102173,产地：山东，枳壳，批号：A1105163,产地：江西，炙甘草，批号：A212L473,产地：甘肃，均购自甘肃省中医院中药房，均经甘肃省中医院李喜香教授鉴定为正品；苯甲酸雌二醇，规格：每支4 mg, 批号：200806,批准文号：批准文号：鲁药字(2016)110252511,宁波第二激素厂生产；黄体酮，规格：每支20 mg, 批号：EB2160,批准文号：国药准字H33020828,浙江仙琚制药股份有限公司生产；枸橼酸他莫昔芬片，规格：每片10 mg, 批号：200905,批准文号：国药准字H31021545,上海复旦复华药业有限公司生产。大鼠E2酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒、大鼠孕激素/孕酮(estrogen and progestational hormone, PROG)ELISA试剂盒、增殖标志物Ki-67(marker of proliferation Ki-67,Ki67)抗体、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)抗体、ERα抗体、ERK1/2抗体、环腺苷酸反应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein, CREB)抗体，均购自武汉塞维尔生物科技有限公司。

仪器BL-420S生物信号采集系统，成都泰盟科技有限公司产品；10705酶标仪，美国Bio-Rad公司产品；GeLView 6000plus凝胶成像系统，广州博鹭腾生物科技有限公司产品。

2 实验方法

2.1 溶液配制

取党参10 g、白术10 g、茯苓10 g、当归10 g、白芍10 g、佛手10 g、炒麦芽10 g、枳壳10 g、炙甘草6 g, 常规浸泡、煎煮，浓缩到每毫升药液含生药1 g, 冷却后置冰箱保存，备用。

2.2 模型建立[4,5]4-5]

用苯甲酸雌二醇+黄体酮复制乳腺增生大鼠模型，用夹尾刺激+饥饱失常复制肝郁脾虚大鼠模型。前20 d, 每日上午9:00在其后肢外侧肌内注射0.5 mg·kg-1·d-1苯甲酸雌二醇，后5 d, 每日上午9:00后肢外侧用肌内注射方式给予5 mg·kg-1·d-1黄体酮注射液；长尾夹进行夹尾刺激，夹子固定于大鼠尾巴中外1/3处，每次不间断刺激30 min, 每日2次，每次间隔3 h; 单日给食，双日禁食，连续造模25 d。

2.3 动物分组与给药方法

从60只大鼠中随机选取10只作为空白组，剩余大鼠全部按“2.2”的方法进行造模，空白组肌内注射等量0.9%NaCl。造模结束后，将成模大鼠随机分为模型组、对照组和高、中、低剂量实验组，每组10只。高、中、低剂量实验组分别灌胃给予17.2、8.6和4.3 g·kg-1归芍运脾汤药剂(等效剂量相当于70 kg成人剂量的12倍、6倍和3倍);对照组灌胃给予4 mg·kg-1他莫昔芬(相当于70 kg成人剂量的6倍);空白组和模型组均给予等量蒸馏水。6组大鼠均持续干预30 d。

2.4 标本采集

于末次灌胃给药后，各组大鼠禁食不禁水24 h, 用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，测定大鼠乳头直径、高度，心脏采血，自胸骨剑突下横开胸膈，沿肋骨角自下而上钝性剥离胸骨，取“乳腺-皮质”组织，沿腹部中线剪开，左侧用多聚甲醛固定，以备病理切片制备，右侧在体视显微镜下分离皮层，保留乳腺组织，-80 ℃冻存，以备后续检测。

2.5 观察大鼠一般生存状况及体征(乳头直径和高度)[6]6]

实验过程中观察各组大鼠一般生存状况(体质量、性情、毛发等)、大鼠乳头(形态、皮色等);测定大鼠乳头直径和高度。

2.6 用ELISA法检测大鼠乳腺组织中E2和P含量[7]7]

取大鼠乳腺组织，制备组织匀浆，严格按试剂盒说明书步骤进行操作，检测E2和P的含量。

2.7 用蛋白质印迹法检测大鼠乳腺组织中ERα、ERK1/2和CREB蛋白的表达水平[7]7]

取冻存乳腺组织0.1 g剪碎后，加入组织裂解液(RIPA+PMSF)后，用匀浆机研磨充分裂解组织，以1.3×104 r·min-1离心10 min, 取上清液，按比例加入5×蛋白上样缓冲液，水浴10 min后得到总蛋白。随后常规电泳、转模、封闭、孵育相应抗体，最后用曝光仪成像，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶为内参计算蛋白相对表达量。

2.8 用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色法观察大鼠乳腺组织病理学改变[7]7]

取“乳腺-皮质”组织，甲醛固定，沿第2对乳头纵切，常规包埋，制备蜡块后切片，用HE染色，在显微镜下观察腺小叶数目、腺泡数目、乳腺导管形态、乳腺上皮细胞排列。

2.9 用免疫荧光染色检测大鼠乳腺组织中Ki67和PCNA蛋白的表达情况[8]8]

取组织蜡块进行切片，组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液(pH=8.0)的修复盒中，于微波炉内进行抗原修复；组织切片用磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution, PBS;pH=7.4)洗涤3次，每次5 min; 滴加BSA,封闭30 min; 用一抗4 ℃孵育过夜；用PBS洗涤，二抗避光室温孵育50 min; 用PBS洗涤，用DAPI染液避光室温孵育10 min; 用PBS洗涤，加入自发荧光淬灭剂5 min, 流水冲洗10 min, 最后封片镜检。

3 统计学处理

用SPSS 24.0软件进行统计分析。实验数据以x¯±s表示，各组间比较用单因素方差分析，方差齐时用LSD法检验，方差不齐时用Tamhane’s T2法检验。

二、结果

1 各组大鼠一般症状与体征

高、中、低剂量实验组分别给予17.2、8.6和4.3 g·kg-1归芍运脾汤药剂；对照组给予4 mg·kg-1他莫昔芬；空白组和模型组均给予等量蒸馏水。

空白组大鼠始终状态良好，皮毛光泽顺滑，体质量稳定增长，乳头色淡，隐约可见；模型组大鼠生存状态差，喜扎堆、反应迟缓，易受激惹，脾气暴躁，体质量增加减缓，腹部毛发脱落明显，乳头色红，明显肿大，高于皮肤；与模型组相比，高、中、低剂量实验组大鼠生存状态不同程度改善，乳头肿胀明显缓解；这说明归芍运脾汤干预效果存在明显的量效关系，尤以高剂量组的效果最为显著。

2 各组大鼠乳头直径和乳头高度的比较

如表1所示：与空白组比较，模型组的乳头直径、乳头高度均显著升高(均P<0.05);与模型组比较，高、中剂量实验组和对照组的乳头直径、乳头高度均有不同程度的下降，尤以高低剂量实验组最为显著(均P<0.05)。

3 各组大鼠乳腺组织病理学改变

如图1所示：空白组大鼠乳腺组织内腺体较少，乳腺导管清晰可见，乳腺导管及管腔没有明显扩张及分泌物；模型组大鼠乳腺组织内腺体增多，面积增大，乳腺导管明显扩张，腺泡腔面积增大，内可见大量分泌物；与模型组比较，高、中、低剂量实验组大鼠乳腺病理改变均有不同程度的减轻，腺体数目减少，乳腺导管扩张减轻、乳腺导管管腔分泌物减少，这说明归芍运脾汤干预效果存在明显的量效关系，尤以高剂量实验组最为显著。

4 各组大鼠乳腺组织中E2和P含量的比较

如表2所示：与空白组比较，模型组大鼠乳腺组织中E2、P含量以及E2/P比值均显著升高(均P<0.05);与模型组比较，高、中、低剂量实验组大鼠乳腺组织中E2含量以及E2/P比值不同程度的降低(均P<0.05)。

表1 各组大鼠乳头直径和高度比较(x¯±s)

图1 各组大鼠乳腺组织病理学改变(苏木精-伊红染色，×100)

5 各组大鼠乳腺组织中Ki67、PCNA蛋白表达水平的比较

低、中、高剂量实验组和对照组、模型组、空白组的Ki67平均光密度值分别为617.29±78.33、440.53±36.76、346.59±42.56、461.52±55.91、831.77±58.79和121.62±18.02,PCNA平均光密度值分别为480.98±20.85、381.77±39.69、256.03±42.99、367.11±56.45、499.87±42.33和176.48±39.50;与空白组比较，模型组大鼠乳腺组织中Ki67、PCNA蛋白表达均显著升高(均P<0.05);与模型组比较，高、中、低剂量实验组乳腺组织中Ki67、PCNA蛋白表达均有不同程度的下调(均P<0.05),尤以高剂量实验组最为显著。

表2 各组大鼠乳腺组织中雌激素(E2)和孕激素(P)含量的比较(x¯±s)

6 各组大鼠乳腺组织中ERα、ERK1/2、CREB蛋白表达水平的比较

如图2所示：低、中、高剂量实验组和对照组、模型组、空白组的ERα蛋白相对表达水平分别为0.87±0.08、0.75±0.08、0.57±0.07、0.65±0.08、0.96±0.08和0.49±0.05,ERK1/2蛋白相对表达水平分别为0.86±0.03、0.83±0.03、0.62±0.02、0.75±0.02、0.88±0.01和0.47±0.01,CREB蛋白相对表达水平分别为0.73±0.07、0.59±0.06、0.54±0.05、0.72±0.07、0.96±0.09和0.48±0.05;与空白组比较，模型组大鼠乳腺组织中ERα、ERK1/2、CREB蛋白相对表达水平均显著升高(均P<0.05);与模型组比较，高、中、低剂量实验组乳腺组织中ERα、ERK1/2、CREB蛋白相对表达水平均有不同程度的下调(均P<0.05),尤以高剂量实验组最为显著。

图2 各组大鼠乳腺组织中雌激素受体α(ERα)/细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)/环核苷酸反应元件结合蛋白(CREB)蛋白电泳图

三、讨论

乳腺增生是女性常见的良性增生性疾病，其临床表现以单侧或双侧乳房周期性疼痛为主。本研究用病证结合的方法复制肝郁脾虚型乳腺增生模型大鼠并给予归芍运脾汤，结果表明，该方能够有效改善模型大鼠的一般生存状况，同时能够显著减小模型大鼠乳头体积，改善乳腺病理改变(小叶数目、腺泡数目、小叶体积、导管和小叶的扩张),这说明归芍运脾汤对于脾虚型乳腺增生大鼠具有显著的治疗作用。

乳腺是“下丘脑-垂体-卵巢轴”轴的靶定调控器官。E2的绝对或相对增加会导致E2/P比值失衡，是导致乳腺腺实质过度增生和退缩的关键因素[9]。本研究中归芍运脾汤给药后显著纠正了E2/P比值失衡状态，抑制了乳腺组织中Ki67和PCNA蛋白表达(均P<0.05)。

目前，学者们认为当E2、P绝对或相对升高时会刺激乳腺组织中E2含量显著升高，最终导致乳腺组织中ERα的过度表达。CREB是一种与多种细胞外信号整合的转录因子，多种细胞内信号通路可激活CREB,包括细胞外信号调节通路ERKs。ERα主要位于细胞核中，扮演配体激活转录因子的角色，其具有非基因组功能，能够通过蛋白质相互作用激活ERK信号通路。本研究结果发现，在归芍运脾汤给药后，显著下调了模型大鼠乳腺组织中ERα、ERK1/2、CREB蛋白表达(均P<0.05)。这说明归芍运脾汤能显著改善肝郁脾虚型乳腺增生模型大鼠的乳腺增生，其机制与调控ERα/ERK/CREB通路关键蛋白表达密切相关。

参考文献:

[1]张银艳,戴子晴,钱江,等.杨德钱应用逍遥散加减治疗乳癖验案一则[J].实用中医药杂志,2023,39(1):172-173.

[2]赵淑丽.逍遥散加味方治疗青年女性乳腺增生的临床疗效及对性激素水平的调节作用[J].现代中西医结合杂志,2021,30(11):1233-1235,1244.

[3]舒劲,武正权,王煜,等.名老中医王自立运脾系列方剂方证知识数据挖掘研究[J].西部中医药,2013,26(2):45-48.

[4]苗明三,温亚娟,白明,等.乳腺增生动物模型制备规范(草案)[J].中国实验方剂学杂志,2017,23(24):17-22.

[5]任培培,王淼蕾,赵丽,等.平胃胶囊对肝郁脾虚腹泻型肠易激综合征大鼠脑肠肽的影响[J].华西药学杂志,2021,36(3):262-267.

[6]巩子星,徐曌,刘远,等.三七总皂苷调控PI3K/Akt/mTOR通路对乳腺增生大鼠乳腺组织细胞凋亡的影响[J].中国实验方剂学杂志,2023,29(2):98-103.

[7]郑君,王煜,屈红,等.基于PTEN/PI3K/Akt信号通路探讨归芍运脾汤防治乳腺增生的机制[J].中国实验方剂学杂志,2023,29(11):113-120.

[8]冯鑫,段永强,白敏,等.基于PTEN/PI3K/Akt信号通路探讨参芪抑瘤方联合顺铂对H22肝癌荷瘤小鼠的抑瘤作用[J].中国实验方剂学杂志,2023,29(3):96-103.

基金资助:甘肃省科技厅自然科学基金资助项目(21JR1RA051);

文章来源:郑君,王煜,屈红等.归芍运脾汤对肝郁脾虚型乳腺增生大鼠的干预作用[J].中国临床药理学杂志,2023,39(21):3149-3153.