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红景天苷激活自噬促进肺癌细胞株A549的凋亡分析
摘要：目的 观察红景天苷对肺癌细胞株A549自噬及凋亡行为的影响，并探究其作用机制。方法 将肺癌细胞A549分为对照组(细胞正常培养),低剂量实验组和高剂量实验组(细胞分别给予40和80μmol·L-1红景天苷处理),3-MA组(细胞给予5 mmol·L-1 3-MA进行处理),3-MA+高剂量实验组(细胞给予5 mmol·L-1 3-MA和80μmol·L-1红景天苷共同处理)。给药24 h后，以噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖水平，以流式细胞术检测细胞凋亡水平，以免疫荧光染色观察A549中自噬相关蛋白轻链3(LC3)荧光强度变化，以蛋白质印迹(Western Blot)实验分别检测细胞中磷酸化磷酸肌醇3激酶(p-PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)蛋白的表达水平。结果 对照组和低、高剂量实验组A549细胞相对存活率分别为100.00%、(61.17±3.16)%和(44.39±2.19)%,细胞凋亡率分别为(3.91±0.67)%、(11.45±0.85)%和(18.09±1.21)%,p-PI3K蛋白相对表达水平分别为1.11±0.08、0.78±0.04和0.40±0.05,p-Akt蛋白相对表达水平分别为0.94±0.03、0.62±0.07和0.32±0.04,p-mTOR蛋白相对表达水平分别为1.16±0.05、0.59±0.06和0.19±0.03,LC3平均荧光强度分别为(51.36±3.02)%、(76.04±3.62)%和(119.88±4.03)%。低、高剂量实验组的上述指标与对照组比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论 红景天苷可激活肺癌细胞A549自噬，抑制增殖并诱导其凋亡，其机制可能与下调PI3K/Akt/mTOR通路相关。
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肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，需开发新的治疗策略。自噬是一种细胞自我调节机制，自噬异常与癌症的发生发展也密切相关[1]。磷酸化磷酸肌醇3激酶(phosphorylate phosphatidylinositol-3-kinases, p-PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)/雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)信号通路在调节细胞增殖、生长、代谢等方面发挥着重要作用，且在多种癌症中都异常活化，同时可抑制细胞自噬行为的发生[2]。红景天苷具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种药理作用，已有研究[3]表明，红景天苷对PI3K相关信号通路具有抑制活性。本研究旨在探讨红景天苷对肺癌细胞株A549自噬及凋亡行为的影响。
一、材料与方法
1 材料
细胞肺癌细胞A549,购自中国科学院细胞库。
药品与试剂红景天苷，规格：1 g, 纯度：98%,批号：A100582106, 3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine, 3-MA),规格：20 mg, 纯度：≥98%,批号：B253572012,均购自上海源叶生物科技有限公司。噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT), Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒，均购自上海碧云天生物技术有限公司；LC3抗体、FITC标记荧光二抗、磷酸化PI3K抗体、磷酸化Akt抗体，磷酸化mTOR抗体，均购自武汉爱博泰克生物科技有限公司。
仪器synergy2多功能酶标仪，美国BioTek公司产品；FACS Caliburwestern分析型流式细胞仪，美国BD公司产品；FV1000激光扫描共聚焦显微镜，日本Olympus公司产品；PowerPace Basic电泳仪，美国BIO-RAD产品；Tanon 5200全自动化学发光图像分析系统，上海天能公司产品。
2 实验方法
2. 1 细胞培养
肺癌细胞A549用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养，置于37 ℃、5%CO2的恒温箱中。
2.2 实验分组
将细胞分为对照组、低剂量实验组、高剂量实验组。对照组、低剂量实验组、高剂量实验组、3-MA组和3-MA+高剂量实验组。对照组细胞正常培养，低剂量实验组和高剂量实验组细胞分别给予40和80 μmol·L-1红景天苷处理，3-MA组细胞给予5 mmol·L-1的3-MA进行处理，3-MA+高剂量实验组细胞给予5 mmol·L-1的3-MA和80 μmol·L-1红景天苷共同处理。
2.3 以MTT法检测细胞增殖水平[4]4]
A549细胞分别接种于96孔板中，每孔5 000个细胞，培养至贴壁后，除对照组外，各实验组使用相应剂量红景天苷处理24 h。吸弃药物，加入5 mg·mL-1 MTT溶液100 μL,37 ℃孵育4 h后，吸弃MTT溶液，各孔加入二甲基亚砜 150 μL,用酶标仪检测570 nm处光密度值，并计算细胞相对存活率：细胞存活率=(实验组光密度值-空白组光密度值)/(阴性对照组光密度值-空白组光密度值)×100%。
2.4 以流式细胞术检测细胞凋亡水平[5]5]
A549细胞分别接种于6孔板中，每孔1.0×106个细胞，培养至贴壁后，除对照组外，各实验组使用相应剂量红景天苷处理24 h。用磷酸盐缓冲液洗涤2次后胰酶消化吹落收集细胞，离心后以磷酸盐缓冲液重悬细胞至适当浓度。加入Annexin V-FITC和PI染料，室温下避光孵育15 min后用流式细胞仪进行分析。
2.5 以免疫荧光染色检测细胞中自噬相关蛋白LC3表达水平[6]6]
4%多聚甲醛室温固定细胞15 min, 0.1% Triton X-100进行室温渗透化处理5 min, 5%BSA室温封闭处理30 min, 随后加入抗LC3一抗，4 ℃孵育过夜后磷酸盐缓冲液洗涤3遍，再使用FITC标记二抗室温避光孵育2 h, 结束后磷酸盐缓冲液洗涤3遍，在荧光显微镜下观察并拍照。
2.6 以蛋白质印迹法(Western Blot)实验检测细胞中p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达水平
A549细胞分别接种于6孔板中，每孔1×106个细胞，培养12 h后，除对照组外，各实验组使用相应剂量红景天苷处理24 h。然后收集细胞并裂解提取总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度。按照参考文献[7]的方法进行电泳和抗体，并用ECL发光底物检测信号。用Image J软件分析条带灰度值，并归一化为β-actin。
3 统计学处理
用SPSS19.0软件对数据进行统计分析。计量资料以x¯±s表示，用单因素方差分析或t检验比较不同组之间的差异。
二、结果
1 红景天苷对肺癌细胞A549增殖的影响
对照组细胞正常培养，低剂量实验组和高剂量实验组细胞分别给予40、80 μmol·L-1红景天苷处理，3-MA组细胞给予5 mmol·L-1的3-MA进行处理，3-MA+高剂量实验组细胞给予5 mmol·L-1的3-MA和80 μmol·L-1红景天苷共同处理。
给药24 h后，对照组和低、高剂量实验组A549细胞相对存活率分别为100.00%、(61.17±3.16)%和(44.39±2.19)%,且低、高剂量实验组与对照组相比，差异均有统计学意义(均P<0.05)。
2 红景天苷对肺癌细胞A549凋亡的影响
给药24 h后，对照组和低、高剂量实验组A549细胞凋亡率分别为(3.91±0.67)%、(11.45±0.85)%和(18.09±1.21)%,低、高剂量实验组与对照组相比，差异均有统计学意义(均P<0.05)。
3 红景天苷对肺癌细胞A549自噬行为的诱导
LC3是探究细胞自噬行为的特征标志物，通过免疫荧光染色实验观察给药24 h后，对照组和低、高剂量实验组A549细胞中LC3的表达水平。对照组和低、高剂量实验组LC3平均荧光强度分别为(51.36±3.02)%、(76.04±3.62)%和(119.88±4.03)%,低、高剂量实验组与对照组相比，差异均有统计学意义(均P<0.05)。与对照组相比，低剂量实验组及高剂量实验组的荧光强度均明显增强，且高剂量组作用强于低剂量组(均P<0.05)。
4 自噬抑制药3-MA对红景天苷效应的抑制作用
对照组、3-MA组、高剂量实验组、3-MA+高剂量实验组相对存活率分别为100.00%、(98.88±2.97)%、(47.10±3.11)%和(68.12±2.62)%。该结果表明3-MA可逆转红景天苷对肺癌细胞的增殖抑制作用，说明红景天苷通过激活自噬对肺癌细胞进行杀伤。
5 红景天苷对肺癌细胞A549中p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达水平的影响
给药24 h后，对照组和低、高剂量实验组A549细胞中p-PI3K蛋白相对表达水平分别为1.11±0.08、0.78±0.04和0.40±0.05,p-Akt蛋白相对表达水平分别为0.94±0.03、0.62±0.07和0.32±0.04,p-mTOR蛋白相对表达水平分别为1.16±0.05、0.59±0.06和0.19±0.03。上述指标，低、高剂量实验组与对照组相比，差异均有统计学意义(均P<0.05)。结果表明，红景天苷可显著下调PI3K/Akt/mTOR信号通路，从而激活细胞自噬并促进细胞凋亡，见图1。
图1 各组细胞中磷酸化磷酸肌醇3激酶(p-PI3K)/磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)/磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)蛋白表达水平
三、讨论
自噬是一种细胞内部的自我消化过程，通过形成自噬泡来将细胞内的蛋白质和细胞器降解为基本组分。这个过程是细胞维持内部稳态的重要机制之一[8,9]。研究表明，自噬在肿瘤细胞的生长、增殖和凋亡中发挥着重要的作用，通过调节自噬的发生可以有效地抑制肿瘤的生长和扩散。在肿瘤细胞中，自噬的调控机制极其复杂，涉及多个信号通路和调控因子的作用。同时，一些蛋白质如B细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)家族成员和Beclin-1等，也被发现在自噬过程中发挥着重要的作用。此外，一些生物活性物质如多巴胺和氧化应激等，也能够影响自噬的调控[10,11]。因此，深入探讨自噬在肿瘤细胞凋亡中的作用和调控机制，有助于更好地了解肿瘤发生和发展的机制，并为肿瘤治疗提供新的靶点。
红景天苷是一种分布于高寒地区的多年生草本植物，其根和根茎富含多种生物活性成分，其中以红景天苷为代表。红景天苷是一种具有广泛药理活性的化合物，其在抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗衰老、保护神经系统等多个方面显示出了显著的生物活性。在抗肿瘤方面，红景天苷已被证实具有抑制多种癌细胞增殖和转移的作用，可能通过影响细胞周期、凋亡、自噬和氧化应激等多个信号通路发挥作用。同时，红景天苷还可以促进肿瘤细胞对放疗和化疗等治疗手段的敏感性，从而提高治疗效果，但其作用机制尚未完全阐明[12]。在红景天苷的生物学效应中，PI3K/Akt/mTOR信号通路发挥着重要作用。PI3K/Akt/mTOR信号通路的不良调控也与多种疾病的发生和发展相关，如癌症、糖尿病、心血管疾病等。如在包括肺癌在内的多种肿瘤中，该信号通路的异常激活可促进细胞生长、增殖、迁移和血管生成，从而加速肿瘤的发生、发展和转移[13,14]。同时，该信号通路的激活也能抑制细胞自噬的发生[2]。因此，研究红景天苷对PI3K/Akt/mTOR信号通路的调节作用以及其对细胞自噬和肿瘤细胞的影响，具有重要的生物学和药理学意义，这也为红景天苷的临床应用提供了理论基础。
本研究的结果显示，红景天苷能够下调PI3K/Akt/mTOR信号通路的活性，促进肺癌细胞系A549的自噬，并抑制细胞增殖，同时促进细胞凋亡。这一发现表明，红景天苷在肺癌治疗方面具有潜在的作用，并为红景天苷抗肿瘤作用的机制提供了新的理论支持。
参考文献:
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文章来源:贲晨,杨大彬,赵伟.红景天苷激活自噬促进肺癌细胞株A549凋亡的作用及机制[J].中国临床药理学杂志,2023,39(21):3102-3105.
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