参芪二皮冬茶系四川省第二中医医院临床经验方，由黄芪、党参、夏枯草等8味中药组成，具有补气健脾\化痰散结之效，可改善脾虚痰瘀所致气虚乏力、胃纳不佳的症状，临床上可用于癌性厌食、肿瘤恶病质的治疗。方中以黄芪、党参为君，补益元气，健脾培中；臣以陈皮、青皮、茯苓、当归理气散寒，宽中行滞，健运肠胃，畅利脏腑；佐以夏枯草、山慈菇清热解毒，消肿散结。使以红茶和胃消滞，下气利导。目前，参芪二皮冬茶以汤剂的形式应用于临床，存在不便携带等缺点，为改善汤剂不足，提高患者使用依从性，本课题组拟将其开发为颗粒制剂，以提高其吸收率、便携性。

本实验考虑各药材的质量标志物，结合提取液的指纹图谱共有峰和各味药材的归属，选取指标性成分毛蕊异黄酮葡萄糖苷(来自黄芪)、迷迭香酸(来自夏枯草)、多糖(来自党参和茯苓等)、橙皮苷(来自橙皮和青皮)、阿魏酸(来自陈皮、青皮、山慈菇和当归)和干膏率，采用星点设计-响应面法，以层次分析法-熵权法考察加水倍数、提取时间，将加水倍数、提取时间经模型拟合和生产实际调整优化的基础上，采用单因素实验对提取次数进行考察优化，为后期制剂开发应用提供参考依据。

1、仪器与材料

e2695型高效液相色谱仪(Waters公司);低速自动平衡离心机(北京时代北利离心机有限公司);HH-21-4型电热恒温水浴锅(上海助蓝仪器科技有限公司);722光栅分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)。

甲醇(分析纯)、乙醇(分析纯)由成都市科龙化学品有限公司提供，甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)均由赛默飞世尔科技有限公司提供，水为超纯水；对照品：迷迭香酸(批号：11871-202007)、毛蕊异黄酮葡萄糖苷(批号：111920-201907)、橙皮苷(批号：110721-202019)、阿魏酸(批号：11-773-201915)均由中国食品药品鉴定研究院提供；药材：黄芪(批号：210608)、党参(批号：210526)、茯苓(批号：210611)、夏枯草(批号：201229)、陈皮(批号：201012)、当归(批号：220209)、青皮(批号：210608)、山慈菇(批号：210608)均由四川省中药饮片有限公司提供，经四川省中医药科学院中医研究所谢守德主任中药师鉴定为正品，红茶购买于四川蒙山红茶有限公司，经海润检测机构鉴定。

2、方法与结果

2.1 供试品溶液制备

称取参芪二皮冬茶处方量药材63 g, 按星点设计-响应面法条件加水煎煮后，常压浓缩至100 mL。

2.2 总多糖含量测定[1,2]1-2]

2.2.1 葡萄糖对照品溶液制备

精密称取适量对照品以蒸馏水溶解于100 mL量瓶中，制成质量浓度为152.4 μg/mL的葡萄糖溶液。

2.2.2 线性关系考察

分别精密吸取葡萄糖对照品溶液0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2 mL置于5 mL容量瓶，加入蒸馏水至刻度线，配成质量浓度梯度为6.10～60.96 μg/mL的系列1～6号对照品溶液。精密吸取各对照品溶液1 mL于10 mL具塞刻度试管中，各加入4 mL 0.2%蒽酮-硫酸试液，摇匀冷却后于沸水中加热10 min, 取出后放置至冷却，于紫外可见分光光度计512 nm下测定吸光度(A)。以葡萄糖质量浓度(C)为X轴，A值为Y轴进行线性回归分析[2,3]。得回归方程A=0.007 27C+0.250 91,R2=0.999 8。

2.2.3 供试品制备

吸取“2.1”项下药液4 mL,加入无水乙醇配置成含药液的80%甲醇，离心，取沉淀部分于水浴锅加热使乙醇挥发，转移沉淀于25 mL量瓶中加入蒸馏水溶解稀释，吸取药液0.5 mL以蒸馏水稀释，以至其液面达到25 mL容量瓶的刻度线，配置成供试品。按照“2.2.2”项下方法对其吸光度进行检测，计算多糖含量。

2.2.4 精密度考察

在512 nm下，对同一对照品连续6次测定吸光度，RSD为1.13%。

2.2.5 稳定性考察

按“2.2.3”项下方法制备供试品，于0、0.5、1、1.5、2、2.5、3 h后测定吸光度，RSD为0.78%,表明样品在3 h内稳定[2]。

2.2.6 重复性考察

按照“2.2.3”项下方法平行制备供试品，计算其多糖含量，其RSD值为1.13%。

2.2.7 加样回收率实验

吸取已知多糖含量的供试品，加入等比例的对照品，平行制备6份样品并测总多糖含量，其平均回收率为99.89%,RSD为2.21%,表明加样回收率良好[1]。

2.3 阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷、迷迭香酸含量测定

2.3.1 供试品制备

精密吸取“2.1”项下样品溶液4 mL于10 mL容量瓶中，加入甲醇使之达到刻度，摇匀后以4 000 r/min离心20 min, 以上清液用0.22 μm微孔滤膜滤过即得。

2.3.2 对照品溶液

将精密称取的毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸对照品分别置于25 mL容量瓶，用甲醇配置成质量浓度为0.808 mg/mL、0.92 mg/mL的2瓶贮备液，将迷迭香酸对照品用甲醇溶解于10 mL容量瓶内，制成1.93 mg/L贮备液，将橙皮苷对照品、不同体积的3种对照品储备液置于25 mL容量瓶内，以甲醇定容，配置成混合对照品(含毛蕊异黄酮葡萄糖苷96.96 μg/mL、迷迭香酸308.8 μg/mL、阿魏酸110.4 μg/mL、橙皮苷872.0 μg/mL)。

2.3.3 色谱条件

Agilent Zorbax SB C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm);流动相为乙腈(A)-0.02%磷酸水溶液(B),梯度洗脱：0～8 min: 2%→3%A;8～18 min: 3%→5%A;18～32 min: 5%→8%A;32～51 min: 8%→11%A;51～84 min: 11%→14%A;84～97 min: 14%→17%A;97～112 min: 17%→20%A;112～148 min: 20%→32%A;148～163 min: 32%→55%A;163～172 min: 55%→90%A;172～175 min: 90%→2%A;175～180 min: 2%A;体积流量1.0 mL/min; 柱温25 ℃;检测波长290 nm; 进样10 μL。取“2.3.1”和“2.3.2”项下供试品溶液和对照品溶液进样，结果阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷、迷迭香酸与相邻峰分离良好，见图1。

图1 阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷、迷迭香酸的高效液相色谱   

2.3.4 线性关系考察

在“2.3.3”项色谱条件下，测定以甲醇稀释配置的“2.3.2”项下贮备液溶液不同质量浓度的对照品峰面积。以各成分的进样浓度质量为X轴，峰面积为Y轴，分别计算回归方程，结果见表1,各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 线性范围与标准曲线方程

2.3.5 精密度考察

在“2.3.3”项色谱条件下，混合对照品连续6次进样，测得阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷、迷迭香酸峰面积的RSD%分别为0.78%、1.26%、0.95%、0.62%。

2.3.6 稳定性考察

在“2.3.3”项色谱条件下同一份供试品放置0、4、8、12、24 h后测得毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷、迷迭香酸峰面积的RSD%分别为1.90%、1.65%、1.91%、2.09%。

2.3.7 重复性考察

按照“2.3.1”项下方法平行制备6份供试品，在“2.3.2”项色谱条件下测得阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷、迷迭香酸含量的RSD%分别1.64%、1.10%、1.62%、1.86%。

2.3.8 加样回收实验

精密移取已知4种指标成分的样品浓缩液1.5 mL于10 mL容量瓶，向药液添加与药液含量接近的阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷、迷迭香酸的对照品，按照“2.3.1”项方法平行制备6份供试品溶液，在“2.3.3”项下色谱条件测定4种成分含量，并计算其的加样回收率，其平均加样回收率分别为99.52%、100.30%、100.64%、101.01%,RSD分别为2.30%、2.04%、2.41%、1.80%。

2.4 指纹图谱的建立及分析

2.4.1 共有峰识别及相似度评价

以中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版),分析响应面实验下的供试品溶液在“2.3.3”色谱条件下所得色谱图，共标定43个共有峰，见图2,相似度在0.993～0.999,说明该提取方法稳定可行。

2.4.2 共有峰归属分析

将处方量药材、单味药材采用相同的提取工艺参数制备供试品，以“2.3.3”项下色谱条件进样，通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版),比对提取液与各药材色谱图的保留时间，以确认43个共有峰的药材归属。共有峰分别来自于黄芪(24号峰) 、陈皮(7、9、13、16、21、22、31、34、43号峰)、当归(22号峰)、红茶(1、3、6、11、12、15、17～19、23、25、26、29、30、37号峰)、青皮(7、13、16、20、22、31、34、39、43号峰)、山慈菇(22号峰)、夏枯草(4、14、35、36、40、41、42号峰),结果见图3。比对对照品的保留时间与提取液色谱峰的保留时间，确认22号峰为阿魏酸，24号峰为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，34号峰为橙皮苷，36号峰为迷迭香酸。

图2 S1～S13的HPLC 指纹图谱   

图3 参芪二皮冬茶提取液、组成药材及混合对照品的 HPLC 色谱  

2.5 提取方法

以加水倍数、煎煮时间作为提取工艺参数，按照表2因素水平，进行工艺优化，称取处方量药材13份，遵循星点效应-响应面(见表3)所列条件进行煎煮后，将药液浓缩至100 mL,制得13批药液，备用，依次记为S1～S13。

表2 提取工艺因素水平

2.6 综合得分计算方法

本实验依据处方君臣佐使配伍关系、药味用量占比及各指标成分药理作用强弱等因素进行考察，将7项指标成分划分为4个层次，确定出各指标的优先顺序为毛蕊异黄酮葡萄糖苷>总多糖=迷迭香酸>橙皮苷=阿魏酸>干膏率，构建判断矩阵，计算各指标主观权重值(w1);依据星点设计-响应面设计所得实验数据建立数据矩阵，将其转化为概率矩阵，计算各指标的信息熵和权重系数(w2),根据公式：wj=w1w2/Σj=1mw1w2,计算组合权重(w),见表4。再计算综合评分，结果见表5。

表3 提取工艺实验设计

2.7 星点设计-响应面法

选取加水量(A)、煎煮时间(B)作为工艺参数，以阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷、迷迭香酸、多糖含量、相似度及干膏率为评价指标，结合“2.6”项下指标权重，计算不同工艺参数的综合评分(Y),结果见表5。

表4 各指标权重值

表5 实验结果

采用Design-Expert 8.0.6软件对将加水量(A)、提取时间(B)与综合得分(Y)进行多元线性回归，得方程为Y=78.7+8.71×A+10.85×B-2.67×AB+1.32A2 -5.22B2,R2=0.982 6,P<0.000 1,可知该模型拟合度较好，误差较小，可用于预测，方差分析见表6,可知A、B均有显著影响(P<0.01),且B对综合评分的影响>A。响应面分析见图4,最终确定最优工艺为加水量12倍，煎煮时间95 min, 综合评分91.92。

表6 方差分析

图4 各因素响应面   

2.8 提取次数考察

取处方量药材，在“2.7”项优化工艺下分别提取1、2、3次，计算综合评分并进行比较，结果见表7。由表7可知，最高综合评分为提取2次，故将提取次数设置为2次。

表7 提取次数综合评分结果

2.9 验证实验

对上述优选工艺参数进行验证，平行3份，结果见表8,可知该工艺具备良好的可预测性、重复性，可为工业生产提供理论依据。

表8 验证实验结果

3、讨论

中药复方通过多个有效成分共同发挥疗效，指纹图谱是一种定性分析手段，进行指纹图谱相似度评价时，可反映出提取时间和加水倍数对药效物质及含量变化的影响。本实验通过对指纹图谱中共有峰的归属和各药材质量标志物的定量，选取毛蕊异黄酮葡萄糖苷、迷迭香酸、橙皮苷、阿魏酸作为指标成分。处方君药黄芪有效成分毛蕊异黄酮葡萄糖苷[3,4]具有调节免疫、肠道菌群等作用；臣药陈皮和青皮的共有成分橙皮苷可发挥抗癌、促进胃肠动力的作用[5,6],阿魏酸作为陈皮、青皮、当归和山慈菇的共有成分，具有抗癌活性，可与川陈皮素共同发挥抗炎、抗氧化应激、促胃动力作用[7,8],臣药党参、茯苓[9,10,11]的有效成分多糖，可抗炎、保护胃黏膜、调节肠道菌群，因此将多糖的含量选为考察指标；佐药夏枯草的有效成分迷迭香酸，可通过抑制肿瘤繁殖与诱导其凋亡的方式发挥抗肿瘤的作用[12,13],干膏率可作为考察中药复方提取效果，故选为考察指标。

本实验选用星点设计-响应面试验，以反馈提取时间和加水倍数的交互作用，考察指标和影响因素之间的非线性关系，因提取次数作为非连续性变量，无法选为响应面考察参数，因而对其进行单独考察；为体现出处方的配伍关系和提取工艺参数对各成分的影响，本实验结合层次分析法(主观赋权法)和熵权法(客观赋权法)计算综合权重，使该评分体系具有综合性与整体性。本实验根据模型拟合结果及生产实际，确定最优提取工艺为12倍量水，提取次数2次，每次提取95 min。本研究确定了最优提取工艺，优化后的提取工艺稳定、可行，可为今后的制剂开发提供参考。

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基金资助:四川省科技计划项目(2021JDZH0013);

文章来源:冉铮婷,李希,冯建安等.星点设计响应面法优化参芪二皮冬茶提取工艺[J].亚太传统医药,2023,19(12):79-84.