健脾化滞丸为南通市中医院院内制剂。目前，所使用的健脾化滞丸处方由炒白术、煨木香、黄连、炒枳壳等12味药组成。其中，炒白术起到健脾助运作用；炒山楂能帮助消积食、化淤滞；炒枳壳可清肺化痰、理气解郁、健脾益胃；煨木香则可以行气宽中、化湿导滞；黄连则主要发挥清热燥湿、泻火解毒的功效[1]。诸药合用，可以起到补脾益气、清热化湿、寒温并调、护膜生肌的作用[2]。临床上主要用来治疗肠易激综合征引起的腹痛、腹泻及结肠炎等。目前，健脾化滞丸尚缺少特定的定性、定量标准，且水泛丸存在服药量大、药效低、加工过程易受环境影响、颗粒大小不均、患者服用时易因剂量差异造成问题等缺点。为增强药效、减少服用量、提高其生物利用度，有必要对健脾化滞丸的制备方法和工艺作出改进，从传统的“水泛丸”向“浓缩丸”方向进行优化。查阅文献可知，健脾化滞丸制备工艺优化相关内容并无报道。参考其他制剂的制备工艺优化过程，多是对单一药材中主要成分进行含量测定[3,4]。本处方中炒白术健脾益气、燥湿利水，是健脾化滞丸发挥健脾作用的主要药材。而白术内酯I对提高唾液淀粉酶的活性、促进胃肠吸收、促进肠道功能效果明显[5]。因此，本实验重点考察健脾化滞丸中的君药炒白术，并对其中白术内酯I成分进行定性鉴别和定量研究。由于《中华人民共和国药典》[6]中未收录白术内酯类成分的提取鉴别及含量测定方法，通过对国内外有关文献的分析，本实验以白术内酯 I含量、成品含水量、溶散时间为主要评价指标，通过正交设计方法对其考察因素的参数进行筛选，以期找到适宜的制备工艺，改善制剂质量。

1、材料

1.1 仪器

戴安U3000型高效液相色谱仪(Thermo Fisher SCIENTIFIC);ZF-1型三用紫外线分析仪(北京启航博达科技有限公司);MS105D型电子天平(METTLER TOLEDO);ME104型电子天平(METTLER TOLEDO);LB-881B型六管崩解仪(上海分析仪器厂);EPED-S2-30DH型实验室超纯水器(南京易普达科技发展有限公司);DHG-9145A型电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司);BHS-2型数显恒温双控水浴锅(宁波市鄞州群安实验仪器有限公司);JP-040S型洁盟牌超声波清洗机(深圳市洁盟清洗设备有限公司);SZ-150A-3型超高速多功能粉碎机(永康善竹贸易有限公司);YUJ-16C全自动速控中药制丸机(天水华圆制药设备科技有限责任公司);BY-800f型不锈钢糖衣锅(江苏泰兴制药机械二厂)。

1.2 药品与试剂

白术内酯I对照品(纯度99.9%,111975-201501,中国食品药品检定研究院);白术对照药材(120983-202106,中国食品药品检定研究院);GF254硅胶板(100 mm×200 mm、50 mm×100 mm, 批号分别为20210809、20211107,青岛海洋化工有限公司);点样毛细管(0.3 mm×100 mm, 苏州市东吴玻璃仪器有限公司);健脾化滞丸(批号：20211115,南通市中医院);处方中药材黄连、槟榔、煨木香、凤尾草、陈皮、姜厚朴、醋莪术均来自南通三越中药饮片有限公司；麸炒枳壳、炮姜、焦山楂、麸炒白术(产地浙江，批号：210810)均来自徐州大彭中药有限公司)。所用试剂主要为乙腈、甲醇、正己烷、异丙醇、二氯甲烷、环己烷、乙醇、乙酸乙酯等，其中乙腈为进口色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2、方法与结果

2.1 健脾化滞丸中白术内酯I的TLC鉴别

2.1.1 对照品溶液的制备

取白术内酯I对照品约1 mg, 精密称定，置10 mL棕色容量瓶中，加入适量甲醇，摇晃使其溶解，稀释至刻度，得白术内酯I对照品溶液。

2.1.2 白术对照药材溶液制备

精密称取0.5 g的白术对照药材粉末置2 mL棕色容量瓶内，加甲醇定容至刻度，超声15 min, 过滤，取滤液，即得。

2.1.3 供试品溶液制备

取健脾化滞丸(批号：20211115)适量于粉碎机中粉碎，用80目的筛网进行筛分，称取5 g细粉放入20 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，超声15 min, 过滤，65 ℃水浴浓缩30 min, 即得健脾化滞丸供试品溶液。同样取炒白术样品药材适量碾碎，过80目筛，按“2.1.2”项方法配制炒白术供试品溶液。

2.1.4 阴性样品溶液制备

按照健脾化滞丸(批号：20211115)的处方称取方中药材，剔除炒白术，依照原健脾化滞丸制备工艺制备成不含炒白术的健脾化滞丸即为阴性样品。然后再按照“2.1.3”项方法制备成阴性样品溶液。

2.1.5 薄层色谱条件及结果

按照《中华人民共和国药典》2020版第四部分通则0502的TLC实验[6],分别吸取配制好的对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液各5 μL,点于105 ℃活化好了的同一硅胶GF 254薄层板上。用环己烷-异丙醇(20∶1,V/V)作为展开剂，提前预饱和20 min, 然后将其放于展开缸内，展开至大约3/4处，拿出，晾干，再用10%的硫酸乙醇溶液均匀喷洒于晾干后的薄层板上，放入105 ℃的烘箱中，加热使其显色，等待3～5 min, 直至有比较明显的条带出现，取出[7]。放入三用紫外线分析仪中，在紫外光365 nm下检视，在供试品的色谱中，与白术内酯I对照品色谱相对应的位置处显示相同颜色的荧光斑点，且阴性对照品未出现干扰[7],见图1。

2.2 制备工艺优化

2.2.1 健脾化滞丸成型工艺研究

(1)制备方法。

①原制备方法：取处方中所列12味药，除凤尾草外，其余药粉碎成细粉，过筛，混匀，凤尾草煎汁，以药汁泛丸，干燥，分装，即得。②现制备方法：按照处方量称取炒白术、炒枳壳、厚朴、煨木香、莪术等药材，粉碎，过筛，混合均匀。再按照处方量称取黄连、槟榔、炒山楂、凤尾草，浸泡，水提，浓缩，与上述细粉混合，采用塑制法制丸、整丸、选丸，干燥，即得。

图1 白术薄层鉴别   

(2)制备工艺。

按处方量称取方中药材，按照现制备方法分别称取需打粉的8味原料药材和需煎煮的4味药材共9份。将打粉后的药材分别用65目、80目、100目的筛网进行筛分；将需煎煮的药材先用蒸馏水浸泡30 min, 然后用2 000 W功率大火煎煮30 min后过滤，改用小火进行二煎，将两次滤液合并，静置24 h后浓缩，最后浓缩至每个处方量对应100 mL的膏汁。然后将3个目数下的药材细粉和相对应的膏汁进行混合，放入全自动制丸机中进行制丸块，制丸条。反复调节至丸条具有适当韧性时进行制丸，然后在糖衣锅中滚圆，挑选出外表光滑圆润、大小均匀的丸剂，按照正交实验中设计的不同干燥温度和干燥时间进行干燥。工艺流程见图2。

图2 工艺流程   

2.2.2 白术内酯I含量测定

(1)色谱条件。

色谱柱：Thermo Acclaim120 C18柱(5 μm, 4.6 mm×250 mm);流动相：乙腈-水(60∶40);流速：1.0 mL/min; 进样量20 μL;柱温30 ℃;检测波长278 nm。采用上述色谱条件，样品可以得到很好分离。缺乏白术的阴性对照品在白术内酯I的出峰部位无吸收，因此不影响其含量测定。

图3 白术内酯I对照品、供试品及阴性对照样品高效液相色谱   

(2)对照品溶液制备。

取适量白术内酯I对照品，精密称量，放入10 mL棕褐色容量瓶中，加适量甲醇，轻摇使其溶解，定容至刻度，获得210 μg/mL的对照品贮存溶液，备用。

(3)线性关系考察。

精密吸取上述对照品储备溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0,4.0 mL,分别放入10 mL棕褐色容量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，配制得到相应浓度的对照品溶液。在上述色谱条件下进样，纵坐标为峰面积，横坐标为质量浓度，得到线性回归方程Y=1 627.2X-3.471 4(r=0.999 4),说明其进样量在2.1～210 μg/mL之间存在较好的线性关系。

(4)供试品溶液制备。

取健脾化滞丸(批号：20211115)适量，粉碎，用80目的筛网筛分，取约5 g, 精密称量，装入配有磨口塞子的锥形瓶中，用移液管精密量取25 mL乙腈，加入锥形瓶中，密塞，称重，超声提取45 min, 冷却后，再称重，加入乙腈，补充减少的质量，过滤，用0.22 μm微孔滤膜滤出滤液，弃去初滤液，取续滤液。

(5)阴性对照溶液制备。

取“2.1.4”项下制成的不含炒白术药材的“健脾化滞丸”适量，按照“2.2.2(4)”中所描述的配制方法将其配制成阴性对照品溶液。

(6)精密度试验。

精密吸取质量浓度为10.5 μg/mL白术内酯I对照品溶液适量，用0.22 μm微孔滤膜过滤后，按上述条件连续进样6次，测定峰面积，RSD为0.99%,说明该仪器的精密度良好。

(7)稳定性试验。

精密吸取同一份健脾化滞丸(批号：20211115)供试品溶液，分别于制备后第0、2、4、6、8、10、12 h时，按照上述色谱条件测定含量，并记录其峰面积。测得其峰面积的RSD为2.85%,表明该溶液在12 h内稳定。

(8)重复性试验。

取相同批次的健脾化滞丸(批号：20211115),按照“2.2.2(4)”项下所述供试品溶液的制备方法，分别配制6份，每份进样2针，6次重复进样，测定白术内酯I的含量，RSD为1.05%,表明该方法重复性良好。

(9)加样回收率试验。

取已知含量的健脾化滞丸(批号：20211115)6份，每份取约1 g, 精密称定，加入1 mL质量浓度为25 μg/mL的白术内酯I对照品(相当于健脾化滞丸样品中白术内酯I含量的80%)。加样供试品溶液的配制方法与上述供试品溶液的配制方法相同，按此方法配制6份加样供试品溶液，然后按照上述色谱条件进行测定，见表1。

表1 加样回收率

2.2.3 水分测定

取按正交设计制备的9份健脾化滞丸样品适量，粉碎，每份取约2 g, 精密称定，按《中华人民共和国药典》2020版0832水分测定法第二法(烘干法)测定[8],直至两次连续称量的质量差≤5 mg, 样品中的水分含量(%)根据减少的质量计算。按《中华人民共和国药典》规定，水分含量≤9.0%。

2.2.4 溶散时限测定

分别取9份制备工艺下的健脾化滞丸各6粒，采用LB-881B型六管崩解仪按《中华人民共和国药典》2020版0108丸剂【溶散时限】检查法测定，样品应在2 h内完全溶散[8]。

2.2.5 正交试验设计方案

通过前期的预试验及以往的生产实践，选取对丸剂质量有明显影响且易于控制的药粉细度(A)、干燥温度(B)、干燥时间(C)作为考察因子，进行L9(33)的正交试验。以白术内酯I含量、含水量和溶散时间作为评价指标，运用SPSS 26.0软件处理本次实验所获得的数据，然后再根据数据结果对每个因素赋予相应的权重值，最后采用综合权重评分方法[9,10]分析实验，见表2、表3、表4、表5。

从表4可以看出，极差R值的大小反映了这三个考察因子对测量结果的影响，其影响的程度依次是干燥温度、干燥时间、粉末细度。从表5可以看出，干燥温度对提取工艺的影响最大。将这3个影响因素和最后综合得分数据导入SPSS 26.0软件，进行事后两两比较，选择出最佳工艺条件为：A3B2C2,即100目的药粉细度，60 ℃的干燥温度，12 h的干燥时间。

表2 正交试验考察因素水平

表4 正交试验安排与结果

表5 综合评分方差分析

2.2.6 验证试验

根据“2.2.5”中的最佳工艺，制备了3批丸剂，并进行了相应的验证实验。据表6实验结果显示，该工艺稳定、合理，所制得的药丸外观光洁、均匀，含水量及溶解时间均满足有关要求。

表6 验证试验结果

3、讨论

3.1 薄层色谱鉴别

有关白术内酯I的薄层色谱鉴定，《中华人民共和国药典》中并无相关记载。本实验刚开始时用《中国药典》中白术薄层鉴别方法进行鉴别[6]发现，按照这种条件进行展开，白术内酯I分离效果差，难以鉴别。通过查阅相关文献，了解到国内外学者多采用甲醇、正己烷和乙醇作为提取溶剂，用环己烷：异丙醇(20∶1,V/V)、环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(4∶1∶1∶0.1)作为展开剂，用10%硫酸香草醛溶液、10%硫酸乙醇溶液、1%的对二甲氨基苯甲醛40%的硫酸乙醇溶液作为显色剂进行显色[7,11,12]。因此，又分别考察了采用正己烷和甲醇提取，应用上述2个展开剂分别进行展开。但由于健脾化滞丸中白术内酯I的含量太少，导致薄层鉴别时的斑点颜色很淡，因而尝试在超声过滤后浓缩滤液，结果发现，用甲醇作为提取溶剂，以环己烷：异丙醇(20∶1,V/V)作为展开剂，喷10% H2SO4-C2H5OH醇溶液后的展开斑点较清晰，白术内酯I可以与其他成分分离，对照品Rf值适当。

3.2 制备工艺设计

在粗试验时，为更好考察哪种制备方法下制得的健脾化滞丸中白术内酯I的含量较高，设计了两种制备方法，一种是将炒白术和处方中其他含挥发油较高的药材打粉；另一种是将炒白术和处方中不含挥发油或含挥发油较少的药材煎汁浓缩。在用全自动制丸机进行丸剂的制备时，由于实验室进行的是小型实验，药粉量太少，不可直接用机器进行制软材，只能手动在制丸机进行丸条制备时，通过丸条的韧性辨别是否达到了制丸的要求，制备过程中发现药粉粒度严重影响丸剂成型性，水分和溶散时限又关乎丸剂质量，因此在考察干燥温度和干燥时间对最后评价指标的影响时，要依据实验室的条件进行合理安排，确保干燥时间和温度的准确性。最后经过含量测定发现，制备方法改造后的两种健脾化滞丸中白术内酯I的含量均明显增加，且前者高于后者。

3.3 提取条件考察

本实验刚开始时是用甲醇作为提取溶剂，但进样后发现溶剂峰太大，在不放大的情况下，在相同保留时间处看不到所测成分的峰形。分析原因可能是由于样品中含所测成分的量比较少，也可能是提取溶剂和流动相不同导致溶剂峰过大。因此，为改善这种情况，尝试了使用与流动相相同的乙腈作为提取溶剂，结果峰形有所改善。为尽可能提高白术内酯I的提取量，本实验设置了L9(33)正交试验来选取最佳提取参数[13]。分别以乙腈浓度(A)65%、80%、100%,乙腈体积(B)25、35、45 mL,超声时间(C)15、30、45 min作为考察因素。以白术内酯I含量作为评价指标，最后选择提取条件为25 mL的100%乙腈超声提取45 min。超声过程中，提取温度会增高，很有可能会影响到白术内酯I的含量，为减少温度的影响本实验在超声容器中放入冰袋来控制温度。

3.4 色谱条件确定

参考近15年关于白术内酯I含量测定的研究，综合色谱条件发现，白术内酯I的检测波长通常为220 nm[14,15],有区别的地方主要集中于色谱柱、流动相及洗脱方法这三个方面。结合实验室条件，本实验优先选择以乙腈-水作为流动相，检测波长设置为220 nm, 结果3D全扫描显示，白术内酯I的最大吸收波长在278 nm处，进而又探究了乙腈与水70∶30、65∶35、60∶40,结果在乙腈与水60∶40的比例下，供试品溶液中白术内酯I和其他峰之间的分离度良好，并可与其他杂质峰达到基线分离，且在阴性对照样品溶液中，相同的保留时间处未出现其他峰干扰。

3.5 权重系数分配

由于白术内酯I是白术发挥健脾运脾作用的主要成分[5],因此本实验主要考察制备工艺对白术内酯I含量的影响，故将白术内酯I含量权重系数定为0.6。通过测定发现9个制备工艺所制丸剂的水分和溶散时限均符合《中国药典》规定，故将权重系数占比降低，均设为0.2。

3.6 其他

学者们研究发现，白术内酯是从白术中分离出来的一类具有显著药理活性的内酯类化合物，包括白术内酯I、白术内酯II和白术内酯III[16]。在细胞色素P450(CYP450)模拟氧化模型中，白术内酯I被氧化为白术内酯III,而白术内酯III是通过脱水转化而转化成白术内酯I,这一观察明显说明白术内酯之间存在相互转化关系[17]。且白术内酯I是一种结晶性的固体，是一种倍半萜内酯类化合物，他的化学性质稳定，较易制得，且其紫外吸收能力比较强，薄层色谱也较易于显色，综合以上性质，本实验选其作为定性鉴别和定量分析的对照品[5]。还有文献报道炮制后白术中苍术酮的含量会有不同程度下降，而白术内酯类成分的含量则会明显增加[18]。因此认为，白术中挥发性成分苍术酮不稳定，预热见光易分解产生白术内酯I[19]。由于白术内酯I见光、长时间放置于空气中会导致其含量下降，因此需将其置于棕色瓶子中避光保存，同时，实验提取对照品和供试品时所留的试样也需放于冰箱中保存。

4、结论

本实验首次薄层定性鉴别了健脾化滞丸中含有白术内酯I成分，为后面的含量测定提供了条件和依据，优化了健脾化滞丸的制备工艺，并按最佳工艺参数制备了健脾化滞丸，其出条顺畅，无粘连，且丸条有较好的韧性，切条后丸粒完好无损坏，滚圆后丸粒圆整。综上所述，所建立的含量测定方法操作简单、方便，可用于健脾化滞丸中白术内酯I的含量测定，优化所得的制备工艺稳定、可行。

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文章来源:王怀远.基于网络药理学和分子对接探讨六神散治疗腹泻的作用机制[J].中国中医药现代远程教育,2023,21(24):155-157.