川芎Ligusticum chuanxiong Hort.(CX），又称Ligusticum wallichii Franchat，来源于伞形科植物川芎的干燥根茎。川芎是一种药食同源类植物，是中国卫生与计划生育委员会收录的“可用于保健食品的中药”之一[1]。川芎油Ligusticum chuanxiong Hort.oil(CXO）是其主要活性物质，已被广泛应用于医药、食品、卫生、化妆品、日用品等多个领域，提高CXO的提取率对CX开发和利用具有重要意义[2]。

目前，常见挥发油提取方法有压榨法、溶剂萃取法、水蒸气蒸馏、盐析辅助水蒸气蒸馏等传统方法，以及分子蒸馏法、微波萃取法、顶空-固相微萃取法、亚临界水萃取法和超临界流体萃取法的现代提取方法。尽管传统方法步骤简单，但其提取率有限[3]，而现代方法对设备要求高，且工艺复杂，在应用和推广方面存在一定困难。这些方法在一定程度上存在时间、人力和资源的浪费，还存在效率低下，无法满足市场需求的问题。

为提高CX的利用率，减少资源浪费，基于文献查询5种传统挥发油提取方法，本研究经实验筛选出提取率最高的方法。与已有的CXO提取研究比较，乙醚-超声萃取法提取时间更短、工艺步骤简单且提取率明显升高。利用响应面实验首次优化了乙醚-超声萃取法提取工艺以实现CXO高效、简易提取。还研究了CXO体外抗氧化活性，可以用作天然抗氧化剂的潜在来源。本研究为CX的合理开发和应用提供了一些基础信息，也为植物源天然药物开发提供了良好基础。

1、实验材料

1.1 药物与试剂

川芎购自成都荷花池中药材市场，经成都中医药大学药学院李楠教授鉴定，为伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort．的根茎。1,1-二苯基-2-苦酰肼（DPPH）购自福州飞净生物科技有限公司。无水乙醚、无水乙醇、液体石蜡、吐温-80、抗坏血酸（VC）、焦没食子酸购自成都科隆化学品有限公司。

1.2 仪器

MH-2000调温型电热套（上海安亭科学仪器厂）；水蒸气蒸馏装置（北京科伟永兴仪器有限公司）；KQ5200DE型超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；UV-6100紫外分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；RE-52AA旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）。

2、实验方法

2.1 提取工艺优化

2.1.1 提取方法筛选

通过查阅中药挥发油提取相关文献，结合现有知识体系及实验条件，选择以下5种提取方法进行实验，并根据公式（1）计算提取率，并筛选提取川芎挥发油的最佳方法。

(1）水蒸气蒸馏法[4]。取CX粗粉100g，加600mL纯化水，浸泡4h，加热，开始回流时计时，提取4h，收集管中的挥发油，3 000r/min离心3min，得到CXO，称重，记录实验数据。平行实验，重复3次，取平均值。

(2）盐析辅助水蒸气蒸馏法[5]。取CX粗粉100g加600mL纯化水，浸泡4h，挥发油提取器中加入饱和氯化钠溶液，加热，开始回流时计时，提取4h，收集提取管中的挥发油，3 000r/min离心3min，得到CXO，称重，记录实验数据。平行实验，重复3次，取平均值。

(3）超声辅助水蒸气蒸馏法[6]。取CX粗粉50g，加800mL纯化水，浸泡2h，超声17min，超声功率200W，加热，开始回流时计时，提取4h，收集提取管中的挥发油，3 000r/min离心3min，得到CXO，称重，记录实验数据。平行实验，重复3次，取平均值。

(4）蒸馏-萃取耦合法[7]。取CX粗粉100g加600mL纯化水，浸泡4h，挥发油提取器中加入1.5mL液体石蜡，加热，开始回流时计时，提取4h，收集提取器中混有萃取剂液体石蜡的挥发油，加入无水乙醇2.5mL，轻摇，3 000r/min离心3min，收集含挥发油的乙醇液，剩余液体石蜡中再加入乙醇0.5mL，轻摇，3 000r/min离心3min，分离出含挥发油的乙醇液，重复操作4次，得到含挥发油的乙醇液，加入等量的质量分数为20%的NaCl溶液，轻摇，3 000r/min离心3min，收集挥发油，剩余乙醇液中加入0.5mL质量分数为20%的NaCl溶液，轻摇，3 000r/min离心3min，收集挥发油，重复操作4次，得到CXO，称重，记录实验数据。平行实验，重复3次，取平均值。

(5）乙醚-超声萃取法[3]。取CX粗粉25g,45℃条件下烘烤3h，加200mL乙醚溶解，保鲜膜密封，0℃下超声提取30min，超声功率200W，然后过滤，滤液经无水硫酸钠干燥，挥去乙醚，得CXO，称重，记录实验数据。平行实验，重复3次，取平均值。

2.1.2响应面法优化提取工艺

(1）单因素实验。以CXO提取率为指标，粒径、烘烤温度、烘烤时间、料液比、超声功率、超声时间为自变量进行单因素实验。针对CX药材粉末粒径大小，基于实验的可行性，选择2020版《中华人民共和国药典》规定的最粗粉、粗粉、中粉、细粉4种粒径水平进行考察，其余因素均从小至大均匀选择5个水平进行实验考察，实验安排见表1。

(2）响应面实验。对单因素实验结果进行多元回归分析，确定与挥发油提取率相关性最大的粒径（A）、烘烤温度（B）和料液比（C）作为变量，进行三因素水平响应面实验，研究它们对CXO提取率的影响。响应面实验设计见表2。  

表1 单因素实验安排 

表2 乙醚-超声萃取法提取CXO条件优化Box-Behnken试验因素与水平  

2.2 川芎挥发油抗氧化实验

2.2.1 CXO清除DPPH能力测定

DPPH是一种稳定的自由基，当自由基清除剂添加到DPPH溶液中时，会导致DPPH中的单个电子变得不稳定。DPPH中的单个电子配对，使溶液的颜色从紫色变为黄色，吸光度值降低，这可以通过分光光度法测量。

样品的DPPH自由基清除能力根据文献提供的方法测定，并进行了一些修改[8]。CXO和抗坏血酸（VC）溶液的质量浓度分别为0.062 5、0.125、0.25、0.5、1、2和4mg/mL。将2.0mL不同质量浓度的样品溶液准确吸移至干净的试管中后，加入2.0mL1×10-4 mol/L DPPH溶液。然后将试管充分摇动并避光0.5h。以无水乙醇为参比，测定各溶液在517nm处的吸光度值（A1）。空白组（A2）使用相同体积的无水乙醇代替DPPH溶液。作为对照组，使用相同量的蒸馏水代替样品溶液（A0）。分别评估和对比CXO和VC的抗氧化能力，所有测定值均为3次结果的平均值。DPPH自由基清除百分比使用公式（2）计算：

2.2.2 CXO清除O2-·能力测定

当焦没食子酸在碱性条件下自动氧化时，会产生稳定的O2-·。如果存在清除O2-·的清除剂，则可以停止红色中间产物的积累，从而降低焦没食子酸自氧化的速率并降低系统的吸光度。

样品的O2-·清除能力使用此前描述的方法并进行了一些修改。CXO和VC溶液的质量浓度分别为0.062 5、0.125、0.25、0.5、1、2和4mg/mL。取pH为8.2的50mmol/LTris-HCl缓冲溶液与样品溶液，混合并在室温下静置4min，在325nm处测量样品的吸光度（Aj）。取3.0mL 7mmol/L焦没食子酸与4.5mL Tris-HCl缓冲溶液，混合并在室温下静置4min后，于325nm处测量吸光度（A0）。根据上述步骤，将1.0mL样品溶液和4.5mL Tris-HCl缓冲溶液，混合并在室温下静置4min后。然后，加入3.0mL焦没食子酸，5min后于325nm波长下测量吸光度（A）。分别评估和对比CXO和VC的抗氧化能力，所有测定值均为3次结果的平均值。O2-·清除百分比使用公式（3）计算：

2.3 统计学分析

所有实验数据均采用SPSS 23.0软件进行统计处理，以表示，并通过单因素方差进行分析。P<0.05或P<0.01表明结果具有统计学意义。

3、实验结果与讨论

3.1 不同提取方法的挥发油提取率

如图1所示，5种方法提取CXO的产率分别为0.41%、0.34%、0.98%、0.29%和3.80%。对实验得到的5种提取方法数据进行单因素方差分析，其中，超声辅助水蒸气蒸馏法和乙醚-超声萃取法的提取率与水蒸气蒸馏法存在显著性差异（P<0.05），其中又以乙醚-超声萃取法的提取率最高。因此，选用乙醚-超声萃取法作为CXO的最佳提取方法，并针对该方法进行后续优选，确定最佳工艺条件。

图1 不同提取方法对CXO提取率的影响   

3.2 单因素实验

研究了粒径、烘烤温度、烘烤时间、料液比、超声功率和超声时间对CXO提取率的影响，结果如图2所示。在一定程度上，中药粉粒径越小，提取率越高。这可能是由于药材粉末的粒径减小，与溶剂接触的表面积相应增加，溶剂更容易渗透至药材内部。且药材粉末过细时，由于吸附作用的增加和药材中大量细胞被破坏的影响，提取率反而略有降低。随着烘烤温度和烘烤时间的增加，CXO的提取率呈起伏的趋势。此外，随着料液比、超声功率和超声时间的增加，CXO的提取率呈增加趋势。

图2 单因素对CXO提取率的影响   

3.3 响应面实验

根据单因素实验结果，利用IBM SPSS Statistics23进行多元线性回归，得出Y(CXO提取率）与A（粒径）、B（烘烤温度）、C（料液比）、D（烘烤时间）、E（超声功率）和F（超声时间）的回归方程（1），如下：

Y(%)=2.026+0.245A-0.333B+0.769C+0.032D-0.136E+0.206F

研究发现，粒径、烘烤温度和料液比对CXO的提取率有很大影响。因此，选择这三个因素作为自变量，选择CXO提取率作为因变量。利用Designexpert进行实验设计，并采用Box-Behnken响应面法优化提取工艺，实验设计和结果如表3所示。

使用Design Expert 8.0.6.1软件分析表2中的实验数据，得出Y(CXO提取率）与A（粒径）、B（烘烤温度）和C（料液比）的回归方程（2），如下：

Y(%)=7.13+0.22A-8.75×10-3 B-1.25×10-3 C+0.075AB+0.12AC-0.012BC-1.4 A2-0.79 B2-0.84×C2

为了测试回归方程的可靠性并确定各种因素对CXO提取率的影响，对回归方程进行了方差分析，结果如表4。结果表明，CXO回归模型极显著（P<0.01），失拟项不显著（P>0.05），表明该模型符合实际，误差较小，可用于CXO提取工艺实验的预测。由于F值反映了各因素对响应值的影响，F值越大，该因素对CXO提取率的影响越大。因此，可以推断出各因素对精油产率的影响如下：A>B>C，即粒径>烘烤温度>料液比。此外，响应面的3D图可以直观地反映两个因素的相互作用，以及每个因素对响应值的影响，如图3所示。 

表3 乙醚超声-萃取法提取CXO的Box-Behnken试验结果  

表4 响应面方差分析 

3.4 验证实验

根据响应面优化结果，EUE提取CXO的最佳工艺为：CX粉粒径为中粉，烘焙温度为40℃，料液比为1:10，在此条件下CXO提取率的预测值为7.13%。根据优化条件，用5g CX中粉进行验证，平行提取3次。表5显示CXO的实际提取率为7.07%，仅较理论最佳值低0.06%。这表明通过响应面优化得到的最佳条件参数可靠，能较好预测实验的提取率，且在CXO的提取中具有可靠性和可重复性。

3.5 CXO的抗氧化作用

CXO具有强大的抗氧化和自由基清除能力。使用VC作为阳性参考，笔者评估了CXO在0.062 5～4.0mg/mL浓度范围内清除自由基的能力，结果如图4所示。结果表明，CXO和VC可以有效清除DPPH和O2-·。CXO的抗氧化能力随样品浓度增加而增加，呈浓度依赖性。此外，不同浓度的VC显示出良好的清除自由基的能力，当CXO浓度增加时，它更接近于VC的清除率，显示出强大的抗氧化活性。

4、结论

本实验选取了常用的几种挥发油提取方法包括水蒸气蒸馏法，超声辅助水蒸气蒸馏法、盐析辅助水蒸气蒸馏法和蒸馏-萃取耦合法及乙醚-超声萃取法。前4种方法提取过程中均有高温加热过程，可能会导致一些热敏成分的氧化，从而使部分挥发性成分无法提取，使得挥发油提取率不高[10,11]。此外，高温加热的提取方法容易出现严重的乳化现象，导致油具有难收集且收率和转移率低、品相差的问题。油的品质差则无法保证质量，且提取后需对乳化液进行后期处理，使工作量增加，工作效率降低[12]。在盐析辅助水蒸气蒸馏中加入饱和氯化钠溶液是为了降低CXO提取中的乳化现象，提高提取率。研究显示，盐是强电解质，在溶液中电离为离子，产生电场。在离子电场作用下，极性较强，具较高介电常数的水分子易与盐离子形成缔合分子，从而降低挥发油在水中的溶解度[13]。液体石蜡作为一种萃取剂，可以实现油的富集和油水分离。由于超声波产生的空泡及坍塌可导致巨大的剪切力，这种剪切力可通过空化作用有效破坏油料的细胞壁或细胞膜，从而释放生物活性物质[14]。与实验结果一致，伴随超声的提取方法得油率大幅提升。此外，由于川芎油的相对密度与水接近，量少时很难聚集成油滴。因此，采取离心的方法能更好分离水和油，继而弃去水层，得到油。致癌、衰老和身体细胞的其他疾病与生物体内自由基过量产生直接且密切相关[15]。本研究结果表明，CXO具有良好的抗氧化活性，并具有较高的自由基清除率。

图3 粒径、烘烤温度、料液比对川芎挥发油提取率交互影响的响应面    

表5 验证实验结果  

图4 CXO和VC的抗氧化能力  

5、总结

在本研究中，以挥发油的提取率为指标，选择了最佳的提取方法EUE。采用响应面法优化了EUE的提取工艺，确定了CXO的最佳提取条件，即粒径为中粉，烘焙温度为40℃，料液比为1:10，预测值为7.13%，实际值为7.07%。还研究了CXO的体外抗氧化活性，发现CXO以剂量依赖的方式清除DPPH和O2-·。CXO作为一种“药食同源”药物，具有很高的安全性，可以用作天然抗氧化剂的潜在来源。由于川芎挥发油具有镇痛镇静、抗炎抗氧化等的药理作用，且含芳香味，其逐渐成为中药药妆行业产品开发的新热点，今后有望开发川芎挥发油面霜、乳膏等护肤品，进一步促进中医药现代化和多元化发展。

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基金资助:成都中医药大学青基进阶人才专项(QJJJ2022014);成都中医药大学乡村振兴专项(XCZX2022007);四川省科学技术厅青年科学基金(2022NSFSC1406);

文章来源:李丹,石爱,于双等.基于响应面优化川芎油提取工艺及抗氧化作用研究[J].亚太传统医药,2023,19(12):50-56.