慢性肾脏病(chronic kidney disease, CKD)是一类由多种病因引起的肾脏疾病，常表现为肾损伤，主要特征为蛋白尿[1]。既往研究常以阿霉素(adriamycin, ADR)诱导啮齿动物模拟CKD发病，发现肾小球足细胞在CKD进展中发挥重要作用[2],但机制有待探讨。脂肪细胞膜相关蛋白质(adipocyte plasma membrane-associated protein, APMAP)是一种新型整合膜蛋白，在肝脏、胎盘和肾脏中含量最高[3],参与多种生物学过程，包括脂肪细胞分化、肿瘤转移、炎性反应和β-淀粉样蛋白生成[4]。在成熟脂肪细胞中抑制APMAP表达可激活NF-κB炎性反应通路，可能参与糖尿病的调控[5]。然而，目前暂不明确APMAP在CKD发生发展中的作用。故本研究拟采用ADR构建阿霉素肾病模型，探讨APMAP在阿霉素肾病肾小球足细胞损伤中的分子机制，以期为研究CKD靶向药物提供潜在靶点。

1、材料与方法

1.1 材料

实验动物、细胞及主要试剂：SPF级SD大鼠30只，雄性，8周龄，体质量300～350 g [湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物生产许可证号：SCXK(湘)2021-0002]。鼠源肾小球足细胞系MPC-5(安徽巨洲生物科技有限公司);ADR、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)检测试剂盒和CCK-8试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司);核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信号通路激活剂CU-T12-9(MedChemExpress公司);胎牛血清、DMEM培养基和胰蛋白酶(Gibco公司);IL-1β、IL-6和TNF-α ELISA试剂盒、BCA蛋白定量检测试剂盒(武汉菲恩生物科技有限公司);APMAP过表达慢病毒(pCMV-MCS-APMAP)及其对照空载慢病毒(pCMV6-MCS-Vector)(上海汉恒生物技术有限公司),其慢病毒滴度均为1.5×108 TU/mL;Nephrin 抗体、APMAP抗体、NF-κB p65抗体、TNF-α抗体和GAPDH抗体(Abcam公司);p-NF-κB p65抗体(Santa Cruze公司);First Strand cDNA Synthesis Kit(武汉塞维尔生物科技有限公司);实时荧光定量PCR(qRT-PCR)试剂盒(Takara公司);annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 大鼠的分组：

将大鼠随机分为正常组(n=15)和模型组(n=15)。模型组尾静脉注射5 mg/kg ADR构建阿霉素肾病模型[6],而正常组注射等体积0.9%氯化钠溶液。饲养期间观察、记录大鼠一般状态及死亡情况。收集大鼠24 h尿液。饲养35 d后采腹主动脉血，分离血清冻存备用；留取大鼠肾脏组织于4%多聚甲醛中浸泡固定。

1.2.2 尿蛋白含量及血清生化指标的检测：

全自动生化仪检测各组大鼠尿液中尿蛋白和血清中总蛋白(total protein, TP)、白蛋白(albumin, ALB)、血尿素氮(blood urea nireogen, BUN)、血肌酐(serum creatinine, Scr)、总胆固醇(total cholesterol, TC)和三酰甘油(triglyceride, TG)水平。

1.2.3 HE染色检测肾组织病理学：

将已固定24 h的大鼠肾组织进行常规制片，苏木精-伊红染色，脱水封片，于400倍镜下观察肾小球损伤情况。

1.2.4 免疫组织化学染色检测肾组织中APMAP和NF-κB p65表达：

将肾组织石蜡切片脱蜡至水，进行抗原修复，3%双氧水溶液阻断内源性过氧化物酶，血清封闭，分别滴加一抗APMAP(1∶200)和NF-κB p65(1∶100),将切片平放于4 ℃湿盒内孵育过夜。滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，室温孵育30 min, 进行 DAB显色，流水冲洗切片终止显色，复染细胞核，脱水封片。阳性染色为棕黄色，随机选取5个视野进行免疫组化阳性信号分析，分别计算各组肾组织中APMAP和NF-κB p65平均阳性表达率。

1.2.5 免疫荧光检测肾组织中APMAP和Nephrin定位情况：

将已脱蜡至水的石蜡切片进行抗原修复，血清封闭，加一抗APMAP(1∶200)和Nephrin(1∶500)于4 ℃孵育过夜，加荧光素标记的二抗(1∶500)室温孵育50 min, DAPI复染细胞核，自发荧光淬灭，封片。红色荧光为APMAP,绿色荧光为Nephrin, 使用荧光显微镜观察肾组织APMAP和Nephrin定位情况。

1.2.6 细胞的培养及慢病毒感染：

将鼠源肾小球足细胞系MPC-5培养于含 10% 胎牛血清、1%双抗的DMEM 培养基中，置于37 ℃、5% CO2 的培养箱中培养。观察细胞增殖状态，当细胞汇合度达到80%～90%时，进行传代培养。取对数增殖期MPC-5细胞培养于6孔板中，将携带pCMV-MCS-APMAP质粒的重组慢病毒载体(pCMV-APMAP)及其对照载体(pCMV6-MCS-Vector)按照感染复数为100对体外培养的MPC-5细胞进行慢病毒感染，并将细胞分为Vector组和pCMV-APMAP组，另设空白(blank)组。感染6 h后更换新鲜培养基，继续培养48 h。qRT-PCR和Western blot法检测感染后MPC-5细胞中APMAP mRNA和蛋白表达水平，验证感染效率。取对数增殖期MPC-5细胞，待细胞增殖至70%汇合度时，采用0.5 μmol/L ADR处理 24 h构建足细胞损伤模型[7]。将MPC-5细胞分成：1)对照(control)组：正常培养；2)ADR组：用0.5 μmol/L ADR处理；3)ADR+vector组：MPC-5细胞感染慢病毒后，再经ADR处理；4)ADR+pCMV-APMAP组：感染慢病毒后，再经ADR处理；5)ADR+pCMV-APMAP+CU-T12-9组：感染慢病毒后，再经ADR和5 μmol/L CU-T12-9处理24 h。

1.2.7 qRT-PCR检测APMAPmRNA:

收集感染慢病毒后的各组细胞沉淀，提取各组细胞中的总RNA,测定总RNA浓度及纯度。按照First Strand cDNA Synthesis Kit说明书步骤，将总RNA反转录成cDNA,然后将cDNA作为模板，GAPDH作为内参，按照qRT-PCR试剂盒说明书进行两步法PCR扩增。扩增参数如下：95 ℃ 30 s; 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 30 s, 40个循环。采用2-ΔΔCt法计算APMAP mRNA相对表达量。引物序列如下，APMAP引物F:5′-CTGTCCTCCGAGACAC CCAT-3′,R:5′-ACTTCCCTGGTCAGTATCAT-3′;GAPDH引物F:5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′,R:5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′。

1.2.8 CCK-8检测细胞增殖活性：

取对数增殖期MPC-5细胞，调整细胞约2×103个/孔细胞接种至96孔板中，同时设置调零孔(培养基对照),每组3个复孔。分组处理后，提前4 h向每孔中加入10 μL CCK-8溶液。孵育结束后，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度值(absorbance, A)。细胞存活率(%)=(A实验组-A空白组)/(A对照组-A空白组)×100%。

1.2.9 流式细胞术检测细胞凋亡率：

收集各组细胞，将5×105个/mL的细胞制成悬液，取1 mL悬液，1 000 r/min离心5 min, 弃上清，加入 195 μL结合液重悬细胞，再依次加入 5 μL annexin V-FITC和10 μL碘化丙啶染色液混匀，室温避光孵育15 min, 立即进行流式细胞仪检测。

1.2.10 ELISA检测LDH活性及IL-1β、IL-6和TNF-α含量：

取大鼠血清及各组细胞上清液，按照试剂盒说明书进行操作，采用酶标仪测定各孔A值，根据标准曲线计算LDH活性及IL-1β、IL-6和TNF-α含量。

1.2.11 Western blot检测蛋白质表达：

收集细胞沉淀，提取细胞总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度。取30 μg总蛋白经煮沸变性，进行10% SDS-PAGE凝胶电泳，将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h, TBST洗涤3次，加入一抗APMAP抗体(1∶1 000)、NF-κB p65抗体(1∶1 000)、p-NF-κB p65抗体(1∶1 000)、TNF-α抗体(1∶1 000)和GAPDH(1∶1 000)抗体稀释缓冲液，于4 ℃孵育过夜。TBST洗涤3次，加入辣酸根过氧化物酶(HRP)标记IgG二抗(1∶10 000)室温孵育1 h, TBST洗涤3次，滴加ECL混合溶液进行显影、定影。使用Alpha软件处理系统分析目标带的A值，计算目的蛋白的相对表达量=目的蛋白的A值/内参蛋白的A值。

1.3 统计学分析

采用SPSS 19.0统计分析软件对数据进行分析，经Shaprio-Wilk法检验所有数据均符合正态分布，计量资料以均值±标准差(x¯±s)表示，两组间比较采用独立样本t检验；多组之间的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。

2、结果

2.1 各组大鼠状态及死亡情况

正常组大鼠状态正常，动作敏捷且活跃，毛色柔顺光滑，粪便成形，垫料干燥，实验期间无死亡。而模型组大鼠自造模第14天时，开始毛色灰黄、杂乱无章， 精神萎靡，饮食减少，粪便不成形，垫料潮湿，实验期间出现5只死亡。

2.2 各组大鼠24 h尿蛋白、血清生化指标及炎性因子变化

第14、21、28、35 天时，模型组大鼠24 h尿蛋白含量较正常组显著升高(P<0.01)(表1)。与正常组比较，模型组大鼠血清中BUN、Scr、TC和TG含量显著升高(P<0.001),ALB含量显著降低(P<0.01)(表2)。与正常组比较，模型组大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α含量显著升高(P<0.01)(表3)。

2.3 各组大鼠肾组织病理学变化及APMAP、NF-κB p65蛋白表达

正常组大鼠肾小管、肾小球和肾小囊形态、结构正常；模型组大鼠肾小球球囊萎缩，肾小管呈蛋白管型，说明阿霉素引起肾损伤(图1)。与正常组比较，模型组大鼠肾组织中APMAP蛋白表达阳性率显著降低(P<0.01),而NF-κB p65蛋白表达阳性率显著升高(P<0.01)(图2)。

2.4 各组大鼠肾组织APMAP和Nephrin定位

APMAP蛋白在大鼠肾小管和肾小球中均有表达，而Nephrin呈串珠样连续性均匀分布于肾小球；与对照组比较，模型组大鼠肾小球中APMAP蛋白荧光减弱，Nephrin呈不连续分布(图3)。

2.5 APMAP过表达对ADR暴露下MPC-5细胞增殖活性的影响

与空白组或vector组比较，pCMV-APMAP组MPC-5细胞中APMAP mRNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.01)(图4A,B)。与对照组比较，ADR组MPC-5细胞增殖活性显著降低(P<0.001);与ADR组比较，ADR+ pCMV-APMAP组MPC-5细胞增殖活性显著升高(P<0.001);与ADR+pCMV-APMAP组比较，ADR+pCMV-APMAP+CU-T12-9组MPC-5细胞存活率显著降低(P<0.001)(图4C)。

表1 各组大鼠尿蛋白含量

表2 各组大鼠血清生化指标变化

表3 各组大鼠血清中炎性细胞因子水平

图1 肾组织病理学变化   

图2 各组大鼠肾组织APMAP、NF-κB p65蛋白表达   

2.6 APMAP过表达对ADR暴露下MPC-5细胞LDH活性及IL-1β、IL-6和TNF-α含量的影响

与对照组比较，ADR组MPC-5细胞中LDH活性及IL-1β、IL-6和TNF-α含量显著升高(P<0.001);与ADR组比较，ADR+pCMV-APMAP组MPC-5细胞中LDH活性及IL-1β、IL-6和TNF-α含量显著降低(P<0.001);与ADR+pCMV-APMAP组比较，ADR+pCMV-APMAP+CU-T12-9组MPC-5细胞中LDH活性及IL-1β、IL-6和TNF-α含量显著升高(P<0.05)(表4)。

2.7 APMAP过表达对ADR暴露下MPC-5细胞凋亡率的影响

与对照组比较，ADR组MPC-5细胞凋亡率显著升高(P<0.001);与ADR组比较，ADR+pCMV-APMAP组MPC-5细胞凋亡率显著降低(P<0.001);与ADR+pCMV-APMAP组比较，ADR+pCMV-APMAP+CU-T12-9组MPC-5细胞凋亡率显著升高(P<0.05)(图5)。

图3 各组大鼠肾组织APMAP和Nephrin定位情况   

图4 APMAP过表达对ADR刺激下MPC-5细胞的影响   

表4 各组细胞LDH活性及IL-1β、IL-6和TNF-α含量

2.8 APMAP过表达对ADR暴露下MPC-5细胞中NF-κB通路蛋白表达影响

与对照组比较，ADR组细胞NF-κB p65、p-NF-κB p65、TNF-α、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表达水平显著升高(P<0.05);与ADR组比较，ADR+pCMV-APMAP组细胞NF-κB p65、p-NF-κB p65、TNF-α、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表达水平显著降低(P<0.01);与ADR+pCMV-APMAP组比较，ADR+pCMV-APMAP+CU-T12-9组细胞NF-κB p65、p-NF-κB p65、TNF-α、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表达水平显著升高(P<0.01)(图6)。

3、讨论

CKD已经成为全球性公共健康问题，其患病率和病死率高。目前大多数慢性肾病难以根治，主要采取的治疗方式为控制并发症和延缓疾病进展，避免进入尿毒症期[7]。寻找新的治疗靶点为CKD患者选择最佳的治疗方法有重要的研究价值。慢性炎性反应、氧化应激、缺氧和衰老在CKD进展和病理生理学中起关键作用[8]。足细胞损伤是导致蛋白尿的主要因素[9]。体内实验结果发现，ADR可引起大鼠体内炎性细胞因子爆发，导致蛋白、脂质、 脂酸等代谢紊乱，肾组织损伤，出现蛋白尿症状，与报道[10]一致。体外实验结果发现，ADR引起肾小球足细胞LDH活性、炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达及细胞凋亡水平升高，细胞存活率降低，证实足细胞损伤可能与炎性反应和细胞凋亡有关。

图5 各处理组足细胞凋亡情况比较   

图6 各处理组细胞中NF-κB p65、p-NF-κB p65、TNF-α蛋白表达水平   

本研究发现，ADR肾病大鼠肾组织 APMAP 低表达，经 APMAP 和Nephrin共定位后，证明肾小球足细胞上的APMAP表达在CKD中发生改变。APMAP可介导NF-κB信号通路调节炎性反应[11]。同时，APMAP具有抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡作用[12]。本研究采用pCMV-MCS-APMAP感染MPC-5细胞，结果发现过表达 APMAP可有效抑制足细胞损伤引起的凋亡和炎性反应，提高足细胞存活率，与上述研究[10,11]结果一致。提示APMAP过表达对足细胞损伤有治疗作用。

体内外实验发现，ADR干预下肾组织及肾小球足细胞中NF-κB p65高表达。足细胞损伤可激活NF-κB 信号通路，加重炎性反应和细胞凋亡[13]。本研究发现，过表达APMAP可下调ADR处理的MPC-5细胞中NF-κB信号通路相关蛋白。本研究采用NF-κB信号通路激活剂CU-T12-9进行联合干预，结果显示CU-T12-9显著升高NF-κB p65激活水平，从而抑制APMAP过表达对肾小球足细胞损伤的改善作用，证实APMAP可能是通过抑制NF-κB 信号通路的激活而降低肾小球足细胞炎性反应和凋亡。

综上所述，过表达APMAP可抑制ADR诱导的肾小球足细胞损伤，其作用机制可能与抑制NF-κB信号通路激活有关。本研究阐明APMAP在阿霉素肾病肾小球足细胞损伤中的作用，为临床寻找新的CKD的防治提供一些理论依据。

参考文献:

[1]张欣,廖晓辉.线粒体功能障碍在急性肾损伤向慢性肾脏疾病转变中的作用[J].基础医学与临床,2021,41:589-592.

[6]李爱平,张王宁,秦雪梅.阿霉素肾病大鼠模型的优化[J].中草药,2018,49:151-159.

[10]张悦,魏民,王谦,等.阿霉素复制大鼠微小病变肾病模型的研究[J].北京中医药大学学报,2002,25:16-18.

[11]黄婧婧,马宇航,王育璠.脂肪细胞膜相关蛋白的研究进展[J].上海交通大学学报(医学版),2017,37:1548-1550+1547.

[12]姜锦鹏,赵茹茜,陈杰,等.脂肪细胞膜蛋白卵黄抗体对脂肪细胞增殖与凋亡的影响[J].中国农业大学学报,2009,14:38-44.

基金资助:苏州市科技计划项目(SYSD2018043);

文章来源:吴静漪,范文静,严冬华.过表达APMAP减轻阿霉素肾病肾小球足细胞损伤[J].基础医学与临床,2023,43(12):1814-1821.