神经血管单元（neurovascular unit,NVU）主要包括神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、脑微血管内皮细胞（brain microvascular endothelial cells,BMECs）、细胞外基质等，各组成间相互协调，共同维持脑组织内环境的整体稳态。脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemic reper‐fusion injury,CIRI）发生后，BMECs、胶质细胞被激活，血脑屏障通透性发生改变，神经元受损凋亡，导致NVU的稳态失衡，从而影响神经系统功能[1,2]。相关研究发现，在NVU微环境中，BMECs不仅可为神经元提供突触间信号传递时所需要的能量，还可在CIRI情况下通过释放脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic fac‐tor,BDNF）调控神经元活性，发挥神经保护作用[3,4]。因此，通过药物干预加强BMECs与神经元之间的信号联系以促进机体自身的内源性修复，对CIRI的治疗具有重要的意义。

本课题组前期研究表明，天麻主要活性成分3,4-二羟基苯甲醛（3,4-dihydroxybenzaldehyde,3,4-DD）具有减轻大脑中动脉闭塞再灌注（middle cerebral artery oc‐clusion/reperfusion,MCAO/R）模型大鼠脑损伤，保护受损神经元的作用[5,6,7]，但作用机制尚不明确。目前常以神经元和BMECs共培养模拟NVU[8]，但是由于原代神经元生长周期长，无法进行传代，故常用中分化型的大鼠肾上腺嗜铬细胞PC12代替神经元进行研究[9]。基于此，本研究采用Transwell小室建立BMECs-PC12共培养氧糖剥夺/复糖复氧（oxygen and glucose deprivation/re‐perfusion,OGD/R）损伤模型，探讨3,4-DD对CIRI的改善作用及机制，以期为CIRI的治疗药物开发提供参考。

1、材料

1.1 主要仪器

3111型CO2细胞培养箱、Quant Studio 5型实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）仪购自美国Thermo Fisher Scientific公司；Ti-S型倒置相差显微镜购自日本Nikon公司；Infinite M200 PRO型酶标仪购自瑞士Tecan公司；ERS-2型细胞电阻仪、Transwell小室（孔径0.4μm，有效膜面积0.33 cm2）购自美国Millipore公司。

1.2 主要药品与试剂

3,4-DD（批号256775）购于北京百灵威科技有限公司；丁苯酞（NBP，批号118170230）购于石药集团恩必普药业有限公司；Prime ScriptTM RT reagent Kit with g DNA Eraser（批号AGH1533A）购自日本Takara公司；0.25%胰蛋白酶、胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）（批号分别为03-050-1A、04-01-1A）购自以色列Biological Industries公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）（批号033100g）购自美国Amresco公司；DMEM/F12培养基、DMEM/RPMI 1640培养基（批号分别为CLL330500B、58903）购自美国Gibco公司；兔抗Ⅷ因子单克隆抗体（批号NB10091761Cy）购自美国Novus Biologicals公司；山羊抗兔荧光单克隆抗体（二抗，批号C2306）购自美国Sigma公司；乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）测试盒（批号QS1001）购自南京建成生物工程研究所；BDNF酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（批号K2401874）购自武汉华美生物工程有限公司。酪氨酸激酶受体B(tyrosine kinase receptor B,Trk B）、磷脂酶c-γ(phospholipase c-γ,Plc-γ）、微管蛋白2(microtubule asso‐ciated protein-2,Map-2）、神经调节素43(growth associ‐ated protein-43,GAP-43）的引物由昆明硕擎生物技术有限公司合成，具体信息见表1。

表1 引物序列及扩增产物长度  

1.3 细胞

大鼠肾上腺嗜铬细胞PC12购自北京北纳创联生物技术研究院，将其以DMEM/RPMI 1640培养基（含10%FBS,40 U/m L青链霉素双抗）于37℃、5%CO2及饱和湿度的培养箱中进行培养。

1.4 动物

本研究所用动物为SPF级SD大鼠，体重250～300g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，动物生产许可证号为SCXK（辽）2015-0001。取成年雌鼠1只、雄鼠2只进行合笼饲养，于第2天观察鼠笼底层是否有阴栓，于见到阴栓之日将雌鼠与雄鼠分开饲养，等待雌鼠生产。饲养环境温度22～24℃，湿度50%～60%,12 h明暗交替。动物实验均经云南中医药大学动物保护委员会批准（批准号为R-06202003）。

2、方法

2.1 原代BMECs分离、培养和鉴定

取出生7 d的乳鼠大脑皮质，用无菌组织剪将皮层组织剪碎，1 000 r/min离心3 min；弃除上清液后按1∶1的体积比加入BSA溶液，并充分吹打混匀，2 500 r/min离心8 min；弃去上清液，收集管底微血管段沉淀，然后接种于DMEM/F12培养基（含20%FBS、40 U/m L青链霉素双抗）的明胶包被培养瓶中，于37℃细胞培养箱中进行培养；24 h后更换新鲜培养液，细胞生长状态稳定后每2 d换液1次。待细胞生长密度达90%，进行传代纯化，取传至第3代的细胞用于实验。取部分BMECs以Ⅷ因子抗体染色后在荧光显微镜下观察，当出现Ⅷ因子阳性表达（呈红色）时，则表明原代BMECs培养成功。

2.2 BMECs-PC12共培养体系构建和OGD/R损伤模型的建立

分别取PC12细胞和BMECs，以磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤2次，加入0.25%胰酶置于37℃培养箱中消化5 min；当80%细胞收缩变圆并漂浮时，向PC12细胞中立即加入含10%FBS的DMEM/RPMI 1640培养基终止消化，向BMECs中加入含20%FBS的DMEM/F12培养基终止消化；将两种细胞以1 000 r/min离心5 min，收集管底细胞沉淀，加入培养基重悬，调整PC12细胞、BMECs的密度分别至1.0×106、4.0×105个/m L。将PC12细胞接种于6孔板中，待其生长1 d后用于共培养实验。将BMECs接种于已提前包被好明胶的Transwell小室内侧，将插入室放入已接种PC12细胞的6孔板中共培养2 d。当两种细胞生长密度达90%时，检测BMECsPC12共培养体系的跨膜电阻（transendothelial electronic resistance,TEER）、PC12细胞中LDH活性；当BMECsPC12共培养体系的TEER和其中PC12细胞中LDH活性相较于两种细胞单独培养显著升高时，则表明BMECs-PC12共培养体系构建成功[10]。

将上述BMECs-PC12共培养体系取出，弃掉原培养基，以PBS清洗细胞后，换入无糖无血清培养基，置于含1%O2的37℃恒温恒湿培养箱中进行氧糖剥夺；8 h后取出，弃去无糖无血清培养基，换入新鲜的完全培养基，置于含5%CO2的37℃恒温恒湿培养箱中进行复糖复氧10 h；复糖复氧结束后，检测BMECs-PC12共培养体系4 h渗漏液面差、TEER、PC12细胞中LDH活性，当4 h渗漏液面差增大，TEER、PC12细胞中LDH活性降低时，表明BMECs-PC12共培养OGD/R损伤模型构建成功[10]。

2.3 分组与给药

将BMECs-PC12共培养体系分为对照组、模型组、NBP组（阳性对照组，0.1 mmol/L，浓度参考文献[11]设置）、3,4-DD组（0.1μmol/L，浓度依据前期研究[7]设置），每组均设置4个复孔。NBP组和3,4-DD组给予相应药物干预Transwell小室内侧BMECs 24 h，对照组和模型组以等量培养基代替，然后除对照组外，其余各组均按“2.2”项下方法复制BMECs-PC12共培养OGD/R损伤模型。

2.4 BMECs-PC12共培养体系的TEER和PC12细胞中LDH活性的检测

氧糖剥夺8 h/复糖复氧10 h后，采用ERS-2型电阻仪检测BMECs-PC12共培养体系的TEER，取平均值。上述检测结束后，取体系中部分PC12细胞进行裂解，然后离心取上清液，按试剂盒说明书方法操作，测定PC12细胞中LDH活性。

2.5 PC12细胞中BDNF水平的检测

“2.4”项下实验结束后，取板底PC12细胞的培养液，然后按ELISA试剂盒说明书方法操作，检测PC12细胞中BDNF水平。

2.6 PC12细胞中Trk B、Plc-γ、Map-2、GAP-43 m RNA表达水平的检测

采用荧光定量PCR法进行检测。“2.4”项下实验结束后，取部分PC12细胞进行裂解，然后用相应试剂盒提取总RNA，逆转录合成c DNA，再以c DNA进行PCR，反应条件为：50℃预处理2 min;95℃预变性2 min;95℃变性15 s,60℃退火1 min,72℃延伸7 min，循环40次。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法检测PC12细胞中Trk B、Plc-γ、Map-2、GAP-43 m RNA的表达水平。

2.7 统计学方法

采用Graph Pad Prism 8.0.1软件进行统计学分析。数据以表示，多组间比较采用单因素方差分析；符合正态分布且方差齐时，组间两两比较采用Dunnett’s t检验；不符合正态分布时，采用秩和检验。检验水准α=0.05。

3、结果

3.1 原代BMECs的分离鉴定结果

结果显示，显微镜下Ⅷ因子呈红色，原代BMECs培养成功。结果见图1。

图1 原代BMECs的分离鉴定结果  

3.2 3,4-DD对共培养体系OGD/R损伤模型的TEER以及PC12细胞中LDH活性及BDNF水平的影响

与对照组比较，模型组BMECs-PC12共培养体系的TEER以及PC12细胞中LDH活性和BDNF水平均显著降低（P<0.01）；与模型组比较，NBP组、3,4-DD组BMECs-PC12共培养体系中上述指标均显著逆转（P<0.05或P<0.01）。结果见表2。  

表2 各组共培养体系的TEER以及PC12细胞中LDH活性和BDNF水平的检测结果（,n=4)  

3.3 3,4-DD对共培养体系OGD/R损伤模型PC12细胞中Trk B、Plc-γ、Map-2、GAP-43 m RNA表达的影响

与对照组比较，模型组PC12细胞中Trk B、Plc-γ、Map-2、GAP-43 m RNA表达水平均显著升高（P<0.01）；与模型组比较，NBP组、3,4-DD组PC12细胞中上述指标表达水平均进一步显著升高（P<0.05或P<0.01）。结果见表3。  

表3 PC12细胞中Trk B、Plc-γ、Map-2、GAP-43 m RNA表达水平的检测结果（,n=4) 

4、讨论

CIRI的发生是由NVU中多种细胞相互作用导致的级联反应，可引起神经炎症的发生、BMECs间紧密连接破坏、脑微环境稳态失调、神经功能受损。BMECs是血脑屏障的结构基础，其产生的BDNF可作用于轴突，为神经元提供营养[12]。TEER是评价紧密连接功能和血脑屏障细胞旁转运的方法[13];LDH存在于所有细胞中，当细胞膜损伤时可快速释放至细胞培养液中，因此常作为衡量细胞是否完整的重要指标[14]。本研究结果显示，BMECs-PC12共培养体系经OGD/R后，TEER、PC12细胞中LDH活性和BDNF水平均降低，提示BMECs-PC12共培养体系的屏障功能被破坏，PC12细胞受损；经3,4-DD干预后，共培养体系的TEER以及PC12细胞中LDH活性和BDNF水平均升高，表明3,4-DD可减轻BMECsPC12共培养体系的OGD/R损伤，并促进BMECs、PC12细胞生成并释放BDNF。

BMECs的旁分泌功能可通过调控BDNF/Trk B信号通路，增加神经元细胞膜上Plc-γ、Map-2、GAP-43蛋白的表达，其中Plc-γ可介导蛋白激酶C调节突触可塑性[15];Map-2是组成神经元细胞骨架的重要组成部分，其表达水平能反映神经元树突的破坏情况[16];GAP-43可参与神经细胞外生长及突触发育形成和神经细胞再生，能调节轴突的延伸作用，增强与G蛋白偶联的受体的转运作用[17]。促进Plc-γ、Map-2、GAP-43的表达可维持神经元轴突和树突的生长，恢复神经元间信号的传导，减轻神经元的损伤[18]。本研究结果显示，BMECs-PC12共培养体系经OGD/R后，PC12细胞中Trk B、Plc-γ、Map-2、GAP-43 m RNA表达水平升高，提示共培养体系在受到OGD/R刺激后，细胞自身触发内源性修复作用；经3,4-DD干预后，PC12细胞中上述指标表达水平均进一步升高，提示3,4-DD可通过作用于Transwell小室上层BMECs，促进BDNF分泌，启动BDNF/Trk B信号通路，调节PC12的突触可塑性，增强BMECs与神经元之间的信号联系以促进内源性修复，进而保护神经元。

综上所述，3,4-DD可通过作用于BMECs减轻神经元OGD/R损伤，其作用机制可能与激活BDNF/Trk B信号通路有关。由于本实验无法充分反映细胞间和细胞外基质的相互作用，后续还需要观察多个细胞之间的相互作用，进一步探讨3,4-DD保护神经元的作用机制。

参考文献:

[1]刘抒雯,杨丽华,马春,等.中医药保护脑缺血再灌注损伤后神经血管单元的作用[J].中国实验方剂学杂志,2018,24(23):225-234.

[3]夏霜莉,杨媛,廖陈,等.3,4-二羟基苯甲醛作用星形胶质细胞减轻脑微血管内皮细胞和神经元氧糖剥夺/再灌注损伤[J].上海中医药大学学报,2021,35(4):67-72,100.

[4]吴雄枫,袁绘,沈红健,等.静脉溶栓治疗反复短暂性脑缺血发作的疗效分析[J].第二军医大学学报,2022,43(1):55-59.

[5]何芳雁.天麻对MCAO/R模型大鼠血脑屏障的保护作用及机制研究[D].昆明:云南中医学院,2015.

[6]颜汉文.天麻酚性成分对神经血管单元的保护作用[D].昆明:云南中医学院,2017.

[7]吴盛友.天麻酚性成分对PC12细胞及胎鼠皮层神经元OGD/R损伤保护作用的研究[D].昆明:云南中医学院,2013.

[8]李长香.精制清开灵及其组分对体外神经血管单元的保护作用及机制的研究[D].北京:北京中医药大学,2019.

[10]薛强.“脑神经血管单元”体外模型的成模性研究[D].重庆:西南大学,2013.

[11]李静.丁苯酞活化AMPK调控线粒体生成对脑缺血/再灌注损伤的保护作用[D].沈阳:中国医科大学,2022.

基金资助:云南省教育厅科学研究基金项目(No.2023Y0457);

文章来源:王锦,夏霜莉,杨媛等.天麻活性成分减轻大鼠神经元氧糖剥夺/复糖复氧损伤的作用机制[J].中国药房,2023,34(23):2886-2890.