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杨树桑黄水提液对果蝇寿命和繁殖力及寿命相关基因的影响

2023-12-18 86 上传者：管理员

摘要：研究不同质量浓度(0.1、1.0、10.0、50.0μg·mL-1)杨树桑黄(Sanghuangporus vaninii)水提液对果蝇平均寿命、半致死时间、最长寿命、蛹数量和F1代羽化成虫数量的影响；采用定量PCR方法检测1μg·mL-1杨树桑黄水提液饲喂果蝇后第1、3、5、10、20天与寿命、免疫相关基因的表达量。结果表明：在实验范围内，与对照相比，1.0μg·mL-1水提液延长果蝇平均寿命，0.1、1.0μg·mL-1水提液延长成虫半致死时间；1.0μg·mL-1水提液增加F1代羽化成虫数量；基因TEP、BrC, E74B、JHEH均在第3天相对表达量较高；基因INDY、EcRB、Srl、TPI均在第10天相对表达量较高；基因TotA,、Dros、TotX均在第20天相对表达量较高。

关键词：
基因表达
寿命
果蝇
桑黄
药用功能
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桑黄又名桑耳，是一类重要食药用真菌的总称，隶属于担子菌门（Basidiomycota）、伞菌纲（Agaricomycetes）、锈革孔菌目（Hymenochaetales）、锈革孔菌科（Hymenochaetaceae）、桑黄孔菌属（Sanghuangporus)[1,2]，有“森林黄金”的美称[3]。桑黄含有黄酮、多糖、多酚、萜类等多种生物活性成分[4,5]，是食药用真菌的研究热点[6]。桑黄子实体水提物具有抗氧化、抗肿瘤、抗衰老、提高免疫力、抗纤维化、抗肺炎等功效[7]，但其对抗衰老的影响鲜见报道。

抗衰老的目的在于尽可能延长寿命，并在此基础上提高生命活力，以提高免疫力、提高抗氧化能力、促进细胞增殖、减缓自由基生成及上调免疫相关基因表达等作为抗衰老的研究内容[8]。果蝇作为重要的模式生物，饲养简单，具有繁殖力强、世代周期短、变异类型多等特点，已被广泛用于生命科学研究的各个领域[9]，是研究基因改造和饮食干预对衰老影响的常用模型[10,11]。因果蝇基因与人类基因相似度高达75%[12]，市场上销售较多的桑黄类产品是杨树桑黄（S.vaninii)[13]，笔者采用杨树桑黄水提液饲喂果蝇，研究其对果蝇寿命、蛹数量、F1代羽化成虫数量及与寿命相关基因的影响。

1、材料与方法

1.1 供试子实体

子实体采摘于吉林省长白山，经北京林业大学戴玉成教授鉴定为杨树桑黄（S.vaninii）。

1.2 果蝇

野生雌、雄黑腹果蝇成虫W1118(D.melanogaster）由美国密苏里大学植物科学技术学院实验室提供。将果蝇置于（25±1）℃、光照和黑暗（12 h∶12 h）条件下培养，以4-24®速溶果蝇培养基（以下简称培养基，美国卡罗莱纳生物公司）饲喂。

1.3 桑黄水提液制备

参考文献[14]的方法制备杨树桑黄水提液。将干燥子实体切成碎块（长、宽约1 cm，高约0.5 cm），按照质量比1∶20加入无菌水，煮沸2 h,12 000 g离心20 min，收集上清液，将残渣以相同方法再次提取，合并2次上清液，分装至50 m L离心管，冻干成粉末，-80℃保存备用。用无菌水溶解水提液粉末，制成100µg·m L-1原液。将原液用无菌水稀释成质量浓度为0.1、1.0、10.0、50.0µg·m L-1的溶液。

1.4 不同质量浓度桑黄水提液对果蝇寿命及蛹数量和F 1代羽化成虫数量的影响

1.4.1 不同质量浓度桑黄水提液对果蝇寿命的影响

分别取14 m L 0.1、1.0、10.0、50.0µg·m L-1杨树桑黄水提液倒入装满4 g培养基的指形直管（4 cm×10 cm），分别接入10只雌果蝇和10只雄果蝇（采用二氧化碳麻醉区分雌、雄成虫）[15]，置于25℃、湿度为50%的培养箱中培养（光照和黑暗12 h∶12 h），以加入14 m L无菌水为对照，每个处理设3次重复。在培养过程中每隔5 d更换培养基，将每管里存活的果蝇转移到对应培养基的指形直管内，每日7:00时观察，统计死亡果蝇数量，直至果蝇全部死亡。

计算不同处理和对照的果蝇平均寿命、半致死时间及最长寿命。果蝇存活总天数的平均数为平均寿命；半数果蝇死亡的天数为半数死亡时间；每组剩余10%果蝇存活天数均值为最长寿命[16,17]。

1.4.2 不同质量浓度桑黄水提液对蛹数量和F1代羽化成虫数量的影响

按照1.4.1的方法，每管接入雌、雄果蝇成虫各10只，培养5 d后将其转至含有不同处理新鲜培养基的管中继续培养（每隔5 d更换一次），直至果蝇成虫死亡。每天记录蛹数量；羽化后，每日观察并记录F1代羽化成虫数量，清除羽化的成虫。

1.5 不同质量浓度桑黄水提液对果蝇免疫及寿命相关基因相对表达量的影响

每个处理接入雌、雄果蝇成虫各50只，每隔5 d更换培养基，将存活果蝇成虫转管到新的培养基中。分别在培养期的第1、3、5、10、20天取雌、雄果蝇成虫各5只用二氧化碳麻醉[12]，用150µL PBS清洗，再用150µL 70%乙醇清洗，置于-70℃冰箱备用。

按照Bactrocera Macquar果实蝇属探针法荧光定量PCR试剂盒（CNR23-4339，巴西贝瑞金公司)说明书检测基因相对表达量，以基因c DNA的3′端序列为模板，采用IDT软件（http://sg.idtdna.com/Primer Quest/Home/Index）设计荧光定量PCR引物[18]（表1）。

荧光定量PCR反应体系：SYBR Green PCR Master Mix 5µL，正、反向引物（10µmo L·L-1）各1µL,c DNA模板1µL，无核酸酶纯水3µL。反应程序：94℃预变性1 min;94℃变性15 s,58℃退火30 s,72℃延伸35 s,40个循环；72℃延伸10 min。每个样品设置3次重复。以rp49为内参基因，以2-ΔΔCT方法计算各目的基因的相对表达量[19]。

表1 引物

1.6 数据统计

数据采用SPSS 22.0软件进行差异显著性分析，采用Duncan’s多重比较分析组间差异，采用Excel 2017软件绘图。

2、结果与分析

2.1 不同质量浓度桑黄水提液对果蝇寿命的影响

在实验范围内，与对照相比，1.0µg·m L-1桑黄水提液显著延长果蝇平均寿命，0.1、1.0µg·m L-1桑黄水提液延长成虫半致死时间，但并未延长最长寿命(表2)。

表2 不同质量浓度杨树桑黄水提液对果蝇平均寿命、半致死时间及最长寿命的影响

2.2 不同质量浓度桑黄水提液对蛹数量和F 1代羽化成虫数量的影响

在实验范围内，不同质量浓度桑黄水提液对果蝇蛹数量的影响差异不显著。与对照相比，1.0µg·m L-1桑黄水提液显著增加F1代成虫羽化数量（图1）。

图1 不同质量浓度桑黄水提液对果蝇蛹数量及F1代成虫羽化数的影响

2.3 不同质量浓度桑黄水提液对果蝇免疫及寿命相关基因相对表达量的影响

在实验范围内，基因TEP、Br C、E74B、JHEH均在第3天相对表达量较高；基因INDY、Ec RB、Srl、TPI均在第10天相对表达量较高；基因Tot A,Dros,Tot X均在第20天相对表达量较高（图2）。1.0µg·m L-1杨树桑黄水提液提高果蝇寿命、免疫相关等基因的相对表达量，从而延长果蝇寿命。

图2 杨树桑黄水提液对果蝇寿命和免疫力相关基因相对表达量的影响

3、讨论

延长寿命是抗衰老的根本，故国内外均以整体寿命实验作为药物延缓衰老的主要方法。提高与寿命及与免疫相关基因的相对表达量从而延缓衰老[8]，在各种衰老模型中已证明饮食的改变与寿命延长、延缓疾病的发生有一定关系[20]，因此，饮食和衰老之间的关系备受关注。葡酒红菇（Russula vinosa)[21]、桦褐孔菌（Fuscoporia obliquus)[22]、蛹虫草（Cordyceps militaris)[23,24]、蝉花（C.cicade)[25]、白灵侧耳（Pleorotus nebrodensis)[26]等提取物的培养基饲喂果蝇，可以延长黑腹果蝇寿命。

笔者研究结果表明，杨树桑黄水提液可以延长黑腹果蝇平均寿命和半致死时间，这可能对衰老干预具有一定意义。杨树桑黄水提液中的物质有促进健康、抑制衰老的作用，因黑腹果蝇天然免疫系统的调节机制与哺乳动物相似[9]，可以推测人类食用杨树桑黄后，同样有提高免疫力，抑制衰老的作用。杨树桑黄水提液可使与抗衰老、免疫反应和生殖相关基因相对表达量上调，这与桑黄饮片水提液提高免疫低下小鼠的非特异性免疫功能[3]、抑制小鼠脾淋巴细胞增殖[27,28]，进而抑制肿瘤生长[29]结果相似。

与对照相比，添加杨树桑黄水提液的培养基污染少，为果蝇的培养提供更有利的生存环境，这可能与杨树桑黄水提液中含有抑菌物质有关[11]。桑黄的活性成分和药理作用与许多因素有关，其中不仅含有多糖[30]，还含有黄酮类、香豆素、三萜类、氨基酸以及酶类等[31,32]，不同有效成分之间是否有协同效果或其他相互作用尚不明确[33]，需要实验验证。

参考文献:

[1]齐梦娇,杜芳,胡清秀,等.杨树桑黄蓝光受体蛋白编码基因SvWC1的克隆及原核表达[J].食用菌学报, 2021,28(2):11-17.

[2]齐梦娇.基于转录组学技术分析光照对杨树桑黄菌丝体生理代谢特性的影响[D].牡丹江:牡丹江师范学院, 2021.

[3]侯玉浩,唐世超,张健,等.杨树桑黄饮片水提物对免疫低下小鼠的免疫功能的影响[J].菌物学报, 2022, 41(6):981-990.

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[6]戴玉成,崔宝凯.药用真菌桑黄种类研究[J].北京林业大学学报, 2014, 36(5):1-7.

[10]吴声华,黄冠中,陈愉萍,等.桑黄的分类及开发前景[J].菌物研究, 2016, 14(4):187-200.

[11]王钦博,杨焱,齐晓彦.桑黄水提物抑菌作用的研究与应用[J].上海农业学报, 2016, 32(6):64-68.

[12]王璐,辛芳,许乐乐,等. 5种麻醉方法对果蝇麻醉效应的探究[J].生物学通报, 2012, 47(5):51-55.

[13]段丹丹,高丽,王珂欣,等.黄芩素通过抗氧化应激延长果蝇寿命的机制[J].药学学报, 2016,51(9):14019-1406.

[14]许光辉,黄亦琦,李廷利.刺五加水煎物对雌雄果蝇寿命影响的实验研究[J].海峡药学, 2012, 24(7):39-41.

[21]甘耀坤,刘英姿,梁钧淞,等.红菇提取液抗衰老作用初探[J].玉林师范学院学报, 2011, 32(5):81-85.