首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 药学论文 > 中药学论文 > 芍药苷对TGF-β1诱导的HK-2细胞纤维化及PI3K/AKT通路的影响

芍药苷对TGF-β1诱导的HK-2细胞纤维化及PI3K/AKT通路的影响

2023-12-18 220 上传者：管理员

摘要：目的探讨芍药苷(paeoniflorin, PF)对转化生长因子-β1(trans-forming growth factor-β1,TGF-β1)诱导的人肾小管上皮细胞HK-2的纤维化作用及磷酸酰肌醇3激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(phosphoinositol 3 kinase and serine-threonine protein kinase, PI3K/AKT)信号通路的影响，并分析其可能的作用机制。方法将HK-2细胞分为对照组、模型组(10μg·L-1 TGF-β1)、PF低剂量组(20μMPF+10μg·L-1TGF-β1)、PF高剂量组(80μM PF+10μg·L-1 TGF-β1)。细胞毒性实验(cell counting kit-8,CCK-8)检测TGF-β1和PF对HK-2细胞活力的影响。蛋白免疫印迹(Western blot)检测α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)、上皮钙黏素(epithelial cadherin, E-cad)及通路相关蛋白p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT的表达。结果与对照组比较，模型组细胞α-SMA、p-PI3K、p-AKT蛋白表达升高(P<0.05或<0.01),E-cad表达降低(P<0.05);与模型组比较，PF组E-cad表达升高(P<0.05),α-SMA、p-PI3K、p-AKT表达降低(P<0.05或<0.01)。结论 PF可减轻TGF-β1诱导的肾纤维化，其机制可能与调控PI3K/AKT信号通路有关。

关键词：
HK-2
PI3K/Akt信号通路
纤维化
芍药苷
转化生长因子-β1
加入收藏

肾脏纤维化是多种慢性肾脏病(chronic kidney disease, CKD)的基本病理过程，纤维化过程会逐渐损害肾脏功能直至肾功能完全丧失，最终导致终末期肾病(end stage renal disease, ESRD)[1]。ESRD患者不断增加，给社会和家庭带来沉重的经济负担，严重威胁人类健康[2]。转化生长因子-β1(transforming growth factor-1,TGF-β1)是促进纤维化进展的重要因子[3],在细胞外基质过度沉积中起着至关重要的作用，其表达水平与肾纤维化程度呈正相关[4]。肾纤维化是由多个信号转导通路和多因素参与的复杂过程。磷酸酰肌醇3激酶 (phosphoinositol 3 kinase, PI3K)是与质膜相关的脂质激酶，受到生长因子等刺激时，激活并与丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(serine-threonine protein kinase, AKT)的PH结构域以及磷酸肌醇依赖性蛋白激酶结合，促使AKT从细胞质中募集到细胞膜上，发生构象变化和双磷酸化，活化的AKT继续作用下游靶蛋白，在细胞增殖、细胞凋亡、上皮间质转分化及炎症反应等多个过程中发挥关键作用[5,6]。

芍药苷(paeoniflorin, PF)是中药芍药的主要活性成分，为水溶性单萜类糖苷化合物，毒副作用低，在体内外具有广泛的药理作用，如抗炎、抗氧化、免疫调节等[7,8]。PF对肾纤维化的作用研究较少，本研究以人肾近曲小管上皮细胞HK-2为研究对象，使用TGF-β1刺激诱导细胞制备肾纤维化模型，观察PF作用细胞后的变化，探讨PF对肾纤维化的作用及具体作用机制，寻找肾纤维化可能的治疗靶点，为肾纤维化的防治提供依据。

1、材料与方法

1.1 材料与试剂

HK-2细胞购于中国科学院上海细胞库，PF[成都乐美天医药科技有限公司(纯度≥98),DSTDS007002],TGF-β1(MCE,HY-P7118),DMEM高糖培养基(北京索莱宝生物科技有限公司，12100),胰蛋白酶(北京索莱宝生物科技有限公司，T1300),南美胎牛血清(Prime, FSP500),细胞毒性实验(cell counting kit-8,CCK-8)试剂盒(GLPBIO,GK10001),α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)抗体(CST,19245S),上皮钙黏素(epithelial cadherin, E-cad)(CST,14472S),PI3K抗体(CST,4257F),p-PI3K抗体(CST,278545),AKT抗体(武汉三鹰生物科技有限公司，60103-2-Ig),p-AKT抗体(武汉三鹰生物科技有限公司，28731-1-Ap)。

1.2 仪器与设备

CO2培养箱(HealForce, HF90),高速离心机(湖南凯达科学仪器有限公司，TGL6A),掌上离心机(武汉赛维尔生物科技有限公司， TGL6A),倒置显微镜(徕卡，DMi1),酶标仪(BioTek, epoch2),近红外双色激光成像系统(Li-COR,2800)。

1.3 方法

1.3.1 细胞复苏和培养

液氮罐中取出冻存细胞，快速放入37 ℃水浴中复苏。转移细胞悬液至离心管中，加等体积完全培养基重悬，1 000 rpm离心5 min, 弃上清液，加2 mL完全培养基重悬细胞，转至培养瓶中，加3 mL完全培养基，放37 ℃、5% CO2培养箱中培养、传代。收集细胞种于12孔板，每孔浓度1×105个，加1 mL完全培养基，37 ℃、5% CO2培养箱中静置培养过夜。

1.3.2 CCK8检测细胞的活性

将细胞接种于96孔板，每孔4×103个，每孔中各加入100 μL完全培养基，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养过夜。分别加入不同浓度TGF-β1(1.25、2.5、5、10、20 μg·L-1)和PF(10、20、40、80、160 μM),每组6个复孔，继续培养6、12、24、48、72 h。各孔分别加入10 mL CCK-8溶液， 1.5 h后，用酶标仪在波长为450 nm时测定吸光度值。

1.3.3 实验分组

对照组：加入与实验组TGF-β1和PF相同体积的PBS;模型组：加10 μg·L-1 TGF-β1;PF低剂量组：20 μM PF干预2 h后，加10 μg·L-1 TGF-β1;PF高剂量组： 80 μM PF干预2 h后，加10 μg·L-1 TGF-β1,均作用48 h。

1.3.4 蛋白免疫印迹(Western blot)检测α-SMA、E-cad、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT蛋白表达

冰上用全细胞裂解液裂解细胞，隔5 min振荡1次，共振荡5次，12 000 g, 4 ℃离心10 min, 取上清液得到总蛋白。BCA测蛋白浓度后配置上样体系，10% SDS-PAGE凝胶电泳2.5 h, 转膜1.5 h, 3.5%的牛血清白蛋白室温封闭2 h, 4 ℃过夜分别孵育一抗α-SMA、E-cad、p-PI3K、PI3K、p-AKT、 AKT,TBST清洗条带3次，每次10 min, 室温孵育二抗2 h, TBST清洗条带3次，每次10 min, 曝光显影，计算灰度值。

1.4 统计学处理

实验进行3次重复，每个指标检测3次，采用GraphPad Prism 6软件进行作图。数据采用IBM SPSS 25.0软件进行统计分析，多组间采用单因素方差分析(one-way analysis of variance, ANOVA)进行比较，数据以均数±标准差(ˉx±s)表示，P<0.05 为差异有统计学意义。

2、结果与分析

2.1 TGF-β1对HK-2细胞活力的影响

CCK-8结果显示，与TGF-β1浓度0 μg·L-1组比较，各浓度TGF-β1对HK-2刺激6 h和12 h, 对细胞活力无影响；刺激24 h, 20 μg·L-1 TGF-β1对细胞活力有显著抑制作用(P<0.01);刺激72 h, 浓度≥2.5 μg·L-1 TGF-β1对细胞活力有显著抑制作用(P<0.05 或<0.01)。因此，本实验选取10 μg·L-1 浓度的 TGF-β1刺激48 h进行细胞纤维化造模后续实验。见图1。

2.2 PF对HK-2细胞活力的影响

CCK-8结果显示，与PF 0 μM组比较，PF刺激6 h对HK-2细胞活力无影响；刺激12 h, 160 μM PF对HK-2细胞活力有抑制作用(P<0.05);刺激72 h, 浓度>20 μM 的PF对细胞活力有显著抑制作用(P<0.05或<0.01)。因此，本实验选取20 μM、80 μM浓度的PF干预48 h进行后续实验。见图2。

图1 TGF-β1对HK-2细胞活力的影响

图2 PF对HK-2细胞活力的影响

2.3 PF对TGF-β1诱导的HK-2细胞纤维化因子α-SMA和E-cad表达的影响

TGF-β1刺激48 h, 与对照组比较，α-SMA表达升高(P<0.01),E-cad表达降低(P<0.01),提示TGF-β1诱导HK-2细胞纤维化造模成功。经过20 μM、80 μM PF预处理后，α-SMA表达降低(P<0.05或<0.01),E-cad表达升高(P<0.05),提示PF可缓解TGF-β1诱导HK-2细胞纤维化相关蛋白的表达，从而缓解纤维化过程，且PF高剂量组的缓解倾向更加显著。见图3。

2.4 PF对TGF-β1诱导的HK-2细胞PI3K/AKT通路相关蛋白表达的影响

实验进一步探讨PF对TGF-β1诱导的HK-2细胞纤维化发生的机制，研究其对PI3K/AKT通路相关蛋白表达水平的影响。与对照组比较，模型组HK-2细胞中p-PI3K、p-AKT蛋白相对表达水平升高(P<0.05);与模型组比较，不同剂量的PF对p-PI3K、p-AKT蛋白相对表达的抑制效果较明显且较为接近(P<0.05或<0.01)。结果表明，PF干预能显著降低PI3K、AKT两种蛋白激酶的磷酸化水平，从而抑制PI3K/AKT信号通路的活化。见图4。

图3 PF对α-SMA、E-cad蛋白表达水平的影响

图4 PF对PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达的影响

3、讨论

肾纤维化主要病理特征为细胞外基质在肾间质过度沉积，成纤维细胞增生，合成大量纤维，是所有慢性肾脏疾病发生和发展的病理基础，也是终末期肾衰竭的主要病理基础和重要途径[9]。当肾小管受到损伤后，在损伤部位出现淋巴细胞、巨噬细胞等炎症细胞浸润，分泌TGF-β1等细胞因子，在TGF-β1作用下肾间质的成纤维细胞活化转变成能表达α-SMA的肌成纤维细胞，而肌成纤维化细胞具有较强的合成细胞外基质的能力，如增加Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白、纤维黏连蛋白等基质蛋白的分泌，减少E-cad的分泌[10,11,12]。所以，TGF-β1是目前公认的最强烈的促纤维化因子，高表达可诱导肾纤维化的发生和发展[13]。

HK-2是人肾近曲小管上皮永生细胞系，其功能完整和培养稳定，本研究选择HK-2作为细胞模型进行实验研究。CCK-8结果显示，<80 μM浓度的PF作用48 h对HK-2细胞增殖无明显影响，而160 μM PF对HK-2细胞有显著毒副作用，所以本研究选择20 μM PF作为低剂量组、80 μM PF作为高剂量组进行后续实验。

肌成纤维细胞是纤维化的主要参与者，以表达α-SMA为特征，正常肾小管上皮表达α-SMA丰度很低，肾纤维化时表达上调，这也是纤维化的重要标志[14]。E-cad是维持肾小管上皮细胞正常结构和形态的细胞黏附因子，细胞缺失E-cad后会丧失多种上皮细胞特征，发生转分化，促进肾纤维化的发生[15]。本研究结果显示，TGF-β1干预后，α-SMA表达升高，E-cad表达降低，提示TGF-β1诱导的肾纤维化细胞模型构建成功。与模型组比较，PF低剂量组、PF高剂量组α-SMA表达降低，E-cad表达升高，提示PF可改善HK-2细胞纤维化进程。

PI3K/AKT通路是细胞内重要的信号转导系统，参与多种疾病的发生、发展过程，包括调节细胞生长、分化及多种酶的活性，并能通过参与炎症途径中单核/巨噬细胞系的浸润和增生、细胞因子的表达、成纤维化细胞活化等在肾纤维化的病理过程中发挥重要作用[16]。MA等[17]研究结果表明，PI3K/AKT信号通路在单侧输尿管梗阻大鼠肾脏中磷酸化增强，YOON等[18]研究结果显示，4-羟基-TEMPD(TEMPOL)可通过PI3K/AKT信号通路减轻单侧输尿管梗阻(UUO)小鼠的肾纤维化，这些研究表明，PI3K/AKT通路参与了肾纤维化的过程，PI3K的化学抑制剂LY294002已被广泛用于研究该通路在正常细胞和转分化细胞的作用[19]。本研究结果发现，与模型组比较，PF低剂量组、PF高剂量组p-PI3K和p-AKT蛋白的相对表达水平均降低，也进一步验证了PI3K/AKT信号通路在肾纤维化进程中的重要性，说明PF可通过抑制PI3K、AKT磷酸化过程减缓肾纤维化进程。

4、结论

PF干预能有效降低TGF-β1诱导的HK-2细胞纤维化标志物α-SMA的表达和升高E-cad的表达，同时PF能下调PI3K/AKT信号通路相关蛋白p-PI3K、p-AKT的表达。PF可能通过调控PI3K/AKT信号通路抑制HK-2细胞纤维化，从而干预肾纤维化。该研究需要进一步的临床试验来验证PF对纤维化的有益作用，并需要进一步在分子水平上阐明PF的作用机制。

参考文献:

[2]胡采红,何泳.柴胡皂苷D介导TGF-β/Smad信号通路对高糖诱导的HK-2细胞纤维化调节作用研究[J].沈阳药科大学学报,2022,39(12):1471-1477.

[9]李玉婷,王林群,刘大伟,等.大黄酸通过激活NRF2/HO-1信号通路改善HK-2人肾小管上皮细胞纤维化的实验研究[J/OL].中药药理与临床,1-15[2023-11-14].

[19]胡双.miR-29b靶向PI3K/AKT通路调控肾间质纤维化的研究[D].武汉:武汉大学,2022.

基金资助:河南省高等学校重点科研项目计划(24A320006);河南省科技攻关计划项目(222102310373);

文章来源:孙韬,宋爽,陈磊等.芍药苷对TGF-β1诱导的HK-2细胞纤维化及PI3K/AKT通路的影响[J].河南医学高等专科学校学报,2023,35(06):611-616.