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金匮肾气丸改善去卵巢幼鼠学习记忆功能的研究

2023-12-19 82 上传者：管理员

摘要：目的：探讨金匮肾气丸对去卵巢幼鼠大脑海马体的影响及其学习记忆功能的关系。方法：将20只雌性幼鼠随机分为5组，假手术对照组、去卵巢模型组、雌激素组、金匮肾气丸低剂量和高剂量组。均于相应措施干预4周后，各组均进行Morris水迷宫实验、血清性激素及海马乙酰胆碱酯酶（AchE）水平检测、大脑组织病理学形态观察，并比较其差异性。结果：金匮肾气丸高剂量组水迷宫实验上台前路程较模型组明显缩短（P<0.05），且其雌二醇和海马AchE水平较模型组高（P<0.001），卵泡刺激素和黄体生成素较模型组低（P<0.001,P<0.05），与雌激素治疗组均无统计学差异。在海马组织形态学方面，金匮肾气丸高剂量组及雌激素组可见海马体神经细胞增殖。结论：金匮肾气丸可一定程度改善去卵巢幼鼠的学习记忆能力，可能与性腺轴的调节和海马形态功能改善相关。

关键词：
卵巢
去卵巢幼鼠
学习记忆功能
激素
金匮肾气丸
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卵巢为女性重要器官之一，具有内分泌及生育功能，对经、孕、产等女性生理现象起重要调节作用。若女童卵巢发育不良，激素水平紊乱，可能造成月经稀少、闭经、不孕等不良后果。亦可能出现特异性的神经心理缺陷，如先天性卵巢发育不全患者可能存在视觉-空间组织缺陷、社会认知障碍、执行功能障碍、运动缺陷等[1,2]，可能造成对生活质量及社会功能的不良影响。肾藏精，其中先天之精禀受于父母，为生殖的基础物质，精生髓，髓上充于脑，《医学心悟》曰：“肾主智，肾虚则智不足……”，可见肾与人体及脑的发育均有密切关系，肾精气亏虚则可能对生殖及认知功能等造成不良影响。金匮肾气丸最早出自《金匮要略》，有“补肾诸方之祖”之称。现将通过动物实验进一步探索金匮肾气丸对去卵巢幼鼠的学习记忆功能的影响，以期为卵巢发育不良女童临床中药治疗提供基础。

1、材料与仪器

1.1 动物

实验动物选择SPF级健康21d龄C57BL/6j雌性小鼠20只，体重15.76±1.25g，购自北京斯贝福实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2019-0010，分笼饲养，环境温度保持20℃～25℃，相对湿度为60%，所有小鼠均在动物房中适应性喂养1周。动物的操作参考《实验动物管理条例》执行，符合规定的伦理要求（编号：MDKN-2023-008）。

1.2 药品与试剂

金匮肾气丸（北京同仁堂科技发展股份有限公司，批号：Z11020147）；补佳乐戊酸雌二醇片（拜耳医药保健有限公司，批号：J20171038）溶于300μl无水乙醇中，待完全溶解后加入1ml过滤除菌的花生油，置涡旋器上混匀15min，充分混匀后再加入花生油，使雌二醇最终浓度为0.32mg/ml；试剂盒（北京华英生物技术研究所，批号分别为HY-C0001、HY-C0002、HY-C0007、HY-M0051）；异氟烷（河北金达福药业有限公司，批号031217015）。

1.3 仪器

ZS/MV麻醉机、Vcap2860水迷宫（众实科技），Nikon Eclipse CI正置光学显微镜、Nikon DS-U3成像系统（日本尼康）；JJ-12J脱水机、JB-P5包埋机、JB-L5冻台（武汉俊杰电子有限公司），RM2016病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）；KD-P组织摊片机（浙江省金华市科迪仪器设备有限公司）；华卫德朗DR-200BS酶标分析仪（无锡华卫德朗仪器有限公司）；迈瑞BS-420全自动生化仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）。

2、实验方法

2.1 造模

将20只小鼠随机分为5组：对照组、模型组、中药低剂量组、中药高剂量组和西药组，每组各4只。对照组为假手术组，其余均为卵巢切除手术组。所有小鼠均经异氟烷气麻，按照文献方法[3]，摘除小鼠双侧卵巢，假手术对照组仅切除卵巢周围的团块脂肪，大小与卵巢一致，其他步骤同去卵巢组。

2.2 干预方法

假手术对照组、模型组予蒸馏水灌胃，西药组予雌二醇（40μg/kg）腹部皮下注射，1次/3d，给药4周；中药低剂量组予金匮肾气丸2g/kg/d、中药高剂量组予金匮肾气丸4g/kg/d灌胃给药，1次/d，连续4周。

2.3 检测指标

2.3.1 Morris水迷宫实验

将水迷宫分为4个象限，内注入自来水，水高约20cm，于第二象限（目标象限）中心放置一个直径为5cm的圆形平台，调节高度使其位于水平面下1～1.5cm，水温保持在25±1.0℃。自由录像记录系统记录小鼠找到平台的时间和活动路径。定位航行试验共历时5d，每日于固定时间段进行，分别从4个象限的入水点将小鼠放入水中，保持入水时头朝池壁，记录小鼠自入水至找到平台四肢爬上平台所需的时间（逃避潜伏期）及入水后活动轨迹。空间探索试验于定位航行试验结束24h后进行，撤除站台，选择站台对称象限将小鼠放入水中，记录小鼠在90s内的活动路径、在目标象限活动的距离和时间，并计算活动距离占总距离的百分比、活动时间占总时间的百分比。

2.3.2 海马组织形态学病理观察

固定后的脑组织先后行脱水、石蜡包埋、切片，烘干脱蜡后进行HE染色、脱水、封片，于光镜下观察并拍摄。

2.3.3 性激素指标、海马乙酰胆碱酯酶（acetyl-cholinesterase,Ach E）测定

采用酶联免疫竞争法，测定小鼠血清中雌二醇（estradiol,E2）、卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone,FSH）、黄体生成素（luteinizing hormone,LH）的含量。取材时根据海马组织的重量，用预冷的生理盐水按体重与体积1∶10的配比混合海马组织与生理盐水，在匀浆机下充分研磨后进行离心，提取上清液，用酶免疫法测定Ach E含量。

2.4 统计学方法

应用STATA14.1软件进行统计学分析。符合正态分布的连续性数据用表示，行多组比较，方差分析有统计学意义后再做组间两两比较，采用LSD Post Hoc Test检验，双侧检验P<0.05表示差异具有统计学意义。

3、结果

3.1 Morris水迷宫实验结果

3.1.1 定位航行实验结果

表1示，各组小鼠训练第1d各指标均不存在统计学差异（P>0.05）。训练第5d，各组上台前路径存在统计学差异（P<0.05）。与对照组比较，模型组、西药组及中药低剂量组的上台前路程显著延长（P<0.001,P<0.05）；与模型组比较，中药高剂量组的上台前路程显著缩短（P<0.05）。而与模型组比较，西药组和中药组的逃避潜伏期有缩短趋势，其中中药高剂量组缩短趋势更明显，但差异均无统计学意义。图1（见封二）示小鼠运动轨迹，对照组、中药组小鼠多以各象限中心区域为主要活动范围，西药组多活动于下水象限，且对照组、中药高剂量组小鼠运动轨迹更平滑，模型组小鼠多于水迷宫边缘活动且轨迹显杂乱。

表1 各组小鼠定位航行实验结果

3.1.2 空间探索实验结果

表2示，撤出隐匿平台后，对照组、西药组、中药2组的目标象限（原平台所在象限）时间比及距离比均高于模型组，其中以西药组、中药高剂量组更明显，但差异均不存在统计学意义（P>0.05）。

3.2 各组小鼠血清E2、FSH、LH及Ach E比较

表3示，对照组小鼠的E2较其他组高，而模型组的E2值最低，且各组间的差异具有统计学意义（P<0.001）。相反，模型组的FSH和LH均高于其他几组（P<0.001）。对照组小鼠的Ach E比其他组高，模型组的Ach E值最低，组间差异具有统计学意义（P<0.05）。

表2 各组小鼠空间探索实验结果

表3 各组小鼠E2、FSH、LH、Ach E水平比较

3.3 海马神经元形态结构改变

HE染色结果如图2（见封二）所示。对照组、中药高剂量组及西药组的脑组织海马体神经细胞形态规则，细胞数量丰富，排列整齐密集，胞核大而圆，染色质少，核仁明显；中药低剂量组可见一侧海马CA3区有极少量的神经细胞胞核固缩深染（小胶质细胞进入受损神经细胞内）、形状欠规则，排列不整齐（图2C黑色箭头）；而模型组可见一侧海马CA3区有较多的神经细胞胞核固缩深染，细胞形状不规则，排列显紊乱（图2B黑色箭头），未见明显的胶质细胞增生。

4、讨论

肾藏真阴、寓元阳，为先天之本、生命之根，若肾气亏虚，精血不足，天癸无以化生，冲任亏虚，遂发育迟缓。肾主骨、生髓，脑为髓海，《医林改错》曰：“小儿无记性者，脑髓未满；高年无记性者，脑髓渐空”，若肾精不足，髓海空虚，大脑失养，日久形成认知问题。正如先天性卵巢发育不全患者，先天禀赋不足，临床多见身材矮小、发育迟缓，结合其情志心理因素，可见部分认知缺陷。可见，“补肾法”或可改善发育迟缓与认知受损。金匮肾气丸作为补肾经方，以六味地黄丸为基础加减化裁而成。《医宗金鉴》云：“此肾气丸纳桂附于滋阴剂中十倍之一，意不在补火，而在微微生火，即生肾气也。”除少量附子、桂枝温肾助阳、引火归原，该方以地黄、山茱萸、山药滋补肾阴，佐以泽泻、茯苓利水渗湿，丹皮凉血化瘀，诸药合用，遂有阴阳双补、徐生肾气之功。肾气充实，天癸化生，有利于推动女性生长发育。研究提示，金匮肾气丸可提高垂体细胞增殖作用、调节下丘脑-垂体-性腺轴中钙调蛋白基因表达，进而改善激素水平[4,5,6]。基于网络药理学等分析，该方中核心成分包括薯藏皂苷元、泽泻醇B、羟基芜花素、去氧穿心莲内酯、胡椒碱、榭皮素等，可作用于雌激素受体a、血管内皮生长因子A、丝氨酸苏氨酸蛋白激酶等核心蛋白靶点，通过调节激素合成与分泌、抗炎、抗氧化等作用治疗早发性卵巢功能不全[7]。而雌激素可通过保护脑神经元细胞、改善脑血流量、调节Ach E活性等机制改善神经认知能力[8,9]。因此，“补肾法”或可通过激素调节等机制改善性腺功能低下个体的神经认知发育。本研究发现，金匮肾气丸高剂量组的E2水平较模型组高，FSH和LH较模型组低，与雌激素治疗组均无统计学差异。提示金匮肾气丸可对各项性激素水平具有改善作用，而学习记忆功能的提升可能与雌激素的间接作用相关。

作为负责学习记忆功能的重要脑区，海马对空间信息的获取及记忆的巩固和储存起关键作用，其中CA3区神经元活动性在空间记忆的编码及检索过程中均升高[10]。成年哺乳动物海马区均有不同程度的颗粒细胞前体增殖，海马神经干细胞分裂增殖越多，动物学习记忆能力越强[11,12]。研究提示金匮肾气丸可改善学习记忆能力，其机制为防止海马细胞氧化损伤、改善能量代谢等[13,14,15]。雷帆等人对金匮肾气丸在小鼠脑海马蛋白质组学的表达进行了研究，提示金匮肾气丸作用蛋白主要涉及膜转运、突触囊泡周期、5-羟色胺能突触、多巴胺能突触等，金匮肾气丸可能对海马区功能存在潜在影响[16]。而Ach E为生物神经传导过程中的关键酶，可调控乙酰胆碱的降解及合成，其纤维的分布以海马内最丰富，在大脑生理活动中起到重要作用[17]。阿尔茨海默症患者皮质与海马体中乙酰胆碱转移酶和Ach E均存在不同程度下降[18]，进而影响乙酰胆碱合成及神经信号传递。既往研究提示，经雌激素或温肾助阳中药干预的去卵巢幼鼠海马Ach E水平升高[19]。本研究中，金匮肾气丸高剂量组水迷宫实验上台前路径较模型组改善明显，与对照组未见统计学差异。而各治疗组幼鼠海马Ach E水平较模型组显著提升，与假手术对照组无统计学差异，可能与幼鼠海马体发育迅速，经治疗乙酰胆碱及其相关酶活性偏高相关。在海马组织形态方面，去卵巢后幼鼠出现脑形态损伤，金匮肾气丸高剂量组及雌激素组可见CA3区海马体神经细胞增殖。提示高剂量金匮肾气丸可对学习记忆能力部分改善，可一定程度减轻脑结构的损伤，其效果与雌激素相当。

综上，金匮肾气丸可一定程度改善去卵巢幼鼠学习记忆水平，或与性腺轴的调节、海马形态及功能的改善相关。由于本研究样本量小、研究指标有限，存在一定的局限性，其机制及远期效果仍待进一步研究。

图1 各组小鼠水迷宫实验代表性运动轨迹图

图2 各组小鼠海马组织CA3区（HE×200)

参考文献:

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