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基于网络药理学与分子对接探讨天名精抗甲型流感病毒机制

2024-01-02 41 上传者：管理员

摘要：目的：基于网络药理学方法对天名精(CAL)抗甲型流感病毒(IAV)潜在化学成分、靶点及作用机制进行分析研究，为后续开发CAL提供参考依据。方法：从中国知网(CNKI)等数据库收集自1988年1月1日至2023年2月25日分离鉴定的CAL化学成分，在SwissTargetPrediction平台预测成分靶点。在GeneCards和OMIM平台收集IAV靶点，导入jvenn取交集基因。利用Cytoscape 3.8.2软件构建CAL-活性成分-IAV网络，在STRING平台分析蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)关系。结合运用DAVIED数据库和微生信平台进行基因本体(GO)功能和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。使用Autodock与Pymol软件将关键药物成分与核心靶点进行分子对接。结果：筛选获得主要潜在活性成分27种，潜在靶点468个，CAL与IAV交集靶点175个。GO功能分析获得97个细胞组分、664个生物过程和150个分子功能；KEGG通路富集分析获得CAL抗IAV信号通路共168条，包括高糖基化终产物-高糖基化终产物受体(AGE-RAGE)、癌症和IAV等通路。分子对接结果显示在前五种核心成分里面，熊果酸与丝裂原活化蛋白激酶(MAPK1)、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)、磷酸肌醇3-激酶调节亚基1(PIK3R1)、磷脂酰肌醇4,5-二磷酸3-激酶催化亚基α(PIK3CA)、非受体型酪氨酸蛋白激酶2(JAK2)、丝氨酸/苏氨酸激酶1(AKT1)有更高结合亲和力。结论：CAL作用于IAV可能涉及多成分、多靶点、多通路共同参与，通过网络药理学分析为CAL抗IAV进一步研究提供思路和方法，为新型抗甲流药物研发提供依据。

关键词：
传染性病原体
分子对接
天名精
甲型流感病毒
网络药理学
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流感病毒(influenza viruses)属正粘病毒科，是常见的传染性病原体之一，可导致人类高发病率和病死率[1]。其特征是包膜具有负链，八节段RNA基因组[2],通常分为甲、乙、丙3种类型，在人类中引起感染的多是甲型流感病毒(Influenza A viruses, IAV)。虽然市面上已存在M2质子通道拮抗剂、神经氨酸酶与聚合酶酸性内切酶抑制剂等抗流感病毒药物[3],但由于IAV具有传染性强、变异性大、流行范围广及易产生耐药性等特点[4,5],对人类生命健康依旧构成重大威胁。因此，发现更安全有效的抗IAV药物对防治IAV具有积极意义。

中药在预防流感病毒感染及其并发症方面有着独特优势[6,7]。一些草药提取物有直接抑制病毒的作用，或通过调节机体免疫功能发挥间接抗病毒的作用，因此开发综合抗病毒作用的中药提取物有着良好的前景[8]。天名精(Carpesium abrotanoides L.CAL)是一种具有重要治疗作用和生物活性的中草药，菊科天名精属，常用于治疗牙痛、淤伤、发热、胃溃疡、扁桃体与支气管炎、细菌及病毒感染等[9],具有止血祛痰、清热解毒之效。其性平，味苦、辛，微毒，果实名为“北鹤虱”[10]。CAL也可作为蛲虫、蛔虫等寄生虫驱虫药，现代药理学证明该植物化学成分具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗病毒和杀虫能力[11]。已有学者发现CAL存在黄酮、酚类、萜类、甾体等数百种化合物，具有良好生物活性，而倍半萜是其主要活性成分[12,13]。本研究通过网络药理学分析探讨CAL主要化学成分的抗IAV感染机制，为后续其活性与机制研究提供参考，为进一步中药抗流感病毒药物的开发提供思路。

1、资料和方法

1.1 数据库与软件分析平台

中国知网(CNKI)、万方数据(WANFANG DATA)、维普中文科技期刊数据库(VIP)、PubMed、Medlinecomplete、核心论文库(CRS)、BATMAN、本草组鉴(Herb)、中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)、PubChem、GeneCards、人类在线孟德尔遗传数据库(OMIM)、DAVIED、PDB数据库、Swiss Target Prediction、Uniprot、jvenn、STRING、微生信平台、Cytoscape 3.8.2、Autodock、Pymol、OpenBabelGUI软件[14,15,16,17,18,19]、Python 2.5程序。

1.2 药物靶点收集

从CNKI、WANFANG DATA、VIP、PubMed、Medlinecomplete、CRS数据库收集CAL 1988年1月1日至2023年2月25日分离鉴定的化学成分，结合BATMAN、Herb数据库已收录的化合物，将得到的化学成分及结构式在TCMSP和PubChem中查找CAS与SMILES式，输入SwissTargetPrediction预测，取probability值>0.1的靶点，删除重复值，Uniprot平台标准化靶点基因。

1.3 疾病靶点筛选

以“influenza A virus”为检索词在GeneCards和OMIM检索IAV靶点，将CAL药物成分与病毒靶点导入jvenn得到成分-疾病靶点交集基因。

1.4 药物成分-靶点-疾病网络与蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络构建

将包含CAL关键活性成分、核心靶点及与IAV交集靶点导入Cytoscape 3.8.2软件网络图。利用STRING平台构建PPI网络，选择“Homo sapiens”,置信度=0.900,获取PPI网络信息，导出为TSV格式，在Cytoscape 3.8.2中优化。

1.5 基因本体(GO)功能和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析

将交集基因输入DAVIED数据库，选择“homo sapiens”,获取生物过程(BP)、细胞组分(CC)、分子功能(MF)及KEGG pathway信息，导入微生信平台进行可视化。

1.6 分子对接

将关键基因名称导入PDB下载蛋白PDB文件，通过Pymol去除蛋白水分子与多余配体，导出为PDB文件；在PubChem中下载小分子配体SDF文件，在OpenBabel中转化为Mol2格式；用Autodock4进行分子对接，计算出蛋白质-配体结合能；用Pymol可视化，绘制分子对接图。

2、结果

2.1 CAL主要成分与潜在作用靶点

经文献与在线数据库共收集到27种CAL潜在活性成分(见表1),468个潜在靶点。

表1 CAL潜在活性成分

2.2 IAV潜在靶点

通过GeneCards和OMIM共收集IAV靶点基因3354个，去除重复值2847个。得到CAL活性成分与IAV靶点交集基因175个。(见图1)

2.3 CAL与IAV网络构建

应用Cytoscape 3.8.2制作网络图(见图2),圆形为靶点，六边形为成分，菱形为CAL,箭头为IAV。字越大、色越深、线越多即degree值越大，其作用越关键。通过Cytoscape3.8.2构建PPI网络图(见图3),计算靶点Betweenness值，按值大小排序，前10靶点为非受体酪氨酸激酶(SRC)、白细胞介素-1B(IL-1B)、雌激素受体1(ESR1)、CREB结合蛋白(CREBBP)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK3、MAPK1、MAPK8)、凝血酶(F2)、前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)、组蛋白脱乙酰酶(HDAC),这10种靶点可能为CAL作用于IAV的核心靶点。

图1 CAL与IAV基因韦恩图

图2 CAL-活性成分-潜在靶点-IAV网络

图3 PPI网络图

2.4 GO功能与KEGG通路富集分析

GO功能富集分析结果显示，CAL作用于IAV涉及97个CC、664个BP、150个MF,选前20组绘制气泡图。CC主要涉及胞核、核浆、核周区域细胞质及质膜等；BP主要涉及蛋白磷酸化与水解、细胞内信号转导、肽酰丝氨酸磷酸化等；MF主要涉及蛋白质与三磷酸腺苷等酶结合、蛋白质酪氨酸激酶及其跨膜受体活性等。KEGG分析共有168条通路，选取20条制作气泡图可知，CAL主要作用通路有高糖基化终产物-高糖基化终产物受体(AGE-RAGE)、癌症通路及癌症中蛋白聚糖、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、脂质与动脉粥样硬化、IAV等。横坐标为富集因子数目，圆形为基因数目，颜色为P值。圆形越大，颜色越深，该条目作用越重要。(见图4)

图4 GO功能与KEGG通路富集分析

2.5 分子对接

通过Autodock计算主要成分与关键靶点结合能(见表2),结合能<-5 kcal/mol表示两者有良好结合活性，值越小，对接结果越理想，结合亲和力越高[33]。对接结果显示postia secoguaianolide与SRC、丝氨酸/苏氨酸激酶1(AKT1);carpesiolin与MAPK3、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)、AKT1;ursolic acid与MAPK1、LCK、磷脂酰肌醇4,5-二磷酸3-激酶催化亚基α(PIK3CA)、非受体型酪氨酸蛋白激酶2(JAK2)、AKT1有较高对接活性。选取结合能前3位通过Pymol可视化，结果见图5。

表2 主要活性成分与关键靶点结合能(PDB ID, kcal·mol-1)

图5 前三对接结果可视化

3、讨论

IAV多于春季流行，可通过影响细胞过程打破机体稳态，感染特征是突然发热、头痛、咳嗽、咽痛和肌肉痛，伴疲劳乏力[34]。中药与人工合成药物相比，具有毒副作用更小、抗病毒谱更广，且对环境污染更少的优势，其多糖、生物碱、维生素等还能有效预防和治疗疾病[35]。CAL主治各种寄生虫感染，其化学成分表现出抗菌、抗肿瘤、抗病毒、抗炎等特性[36],具备深入研究价值。

本研究通过网络药理学分析，共获得CAL主要活性成分27种，潜在靶点468个。通过PPI可视化分析，CAL抗IAV核心靶点可能为SRC、IL-1B、ESR1、CREBBP、MAPK3、MAPK1、MAPK8等。GO功能和KEGG通路富集分析显示，CAL主要通过参与蛋白磷酸化、细胞内信号转导、脂多糖反应、调控凋亡过程等，与AGE-RAGE、癌症、C型凝集素受体、低氧诱导因子-1(HIF-1)信号通路关系密切。同时还参与COVID-19、IAV、糖尿病等调控，对癌症、糖尿病及抗病毒新药开发具有参考价值。从分子对接结果看，CAL主要活性成分与SRC、MAPK3、MAPK1、JAK2、AKT1等核心靶点具有良好的对接活性，其中carpesiolin 和ursolic acid与关键靶点结合亲和力最好。SRC是一种催化ATP上γ-磷酸转移到蛋白酪氨酸残基上的激酶，可直接调控MAPK信号通路上游激活蛋白Ras, 使其与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 Raf-1氨基端结合，激活MAPK,参与细胞增殖分化[36]。MAPK3、MAPK1是信号从细胞表面传递到胞核的重要媒介[37],参与细胞增殖分化、应激与炎症，可调节IAV感染[38]。JAK2/STAT3信号通路可调节机体免疫与多种炎症过程[39],JAK2过表达会促进H5N1流感病毒复制，特异性抑制其表达可减轻病毒复制[40]。AKT1是PI3K/AKT信号通路主要组分，激活后可磷酸化含丝、苏氨酸残基底物，影响细胞增殖、代谢和凋亡[41]。

综上所述，CAL抗IAV通过多成分、多靶点及多通路实现。可参与蛋白水解与磷酸化、细胞凋亡、炎症反应等影响流感病毒在机体复制，从而发挥抗IAV作用。本研究在网络药理学分析基础上初步探索了中药CAL抗流感病毒机制，为后续对其作用机制进一步验证与实验探究奠定了基础。

参考文献:

[10]钱群刚,蔡亮,杨胜辉,等.天名精化学成分的研究[J].中成药,2019,41(11):2671-2675.

[11]汪蕾.天名精倍半萜类化学成分及其细胞毒活性研究[D].宜昌:三峡大学,2018.

[12]陈迪路,李玄,周小江.天名精属植物的倍半萜类成分及其药理活性研究进展[J].中国中药杂志,2020,45(1):37-51.

[13]姚思凡,陈迪路,张艺,等.天名精总倍半萜内酯在大鼠体内的药代动力学研究[J].湖南中医药大学学报,2022,42(8):1255-1260.

[21]胡巧玲.肉桂叶和天名精中化学成分的发现及其生物活性研究[D].兰州:兰州大学,2018.

[22]汪蕾,田丽,程凡,等.天名精萜类化学成分及其细胞毒活性研究[J].中草药,2018,49(3):530-535.

[23]董云发,丁云梅.天名精倍半萜内酯化合物[J].Journal of Integrative Plant Biology,1988(1):71-75.

[27]万明香,何顺志,王悦芸,等.天名精属药用植物的研究现状[J].贵阳中医学院学报,2009,31(6):76-78.

[28]刘翠周,许婧,桂丽萍,等.北鹤虱的化学成分研究[J].药物评价研究,2010,33(3):220-221.

[33]洋雯茜,黄志鸿,袁海胜,等.基于网络药理学的龙菊清肝胶囊治疗原发性高血压作用机制研究[J].时珍国医国药,2021,32(5):1261-1266.