银屑病是以鳞屑性红斑为典型皮损的皮肤病，属于中医学“白庀”的范畴[1]。银屑病病程长，病理表现以皮肤增厚、局部血管增生、免疫性炎症浸润为主要特点[2]。研究表明，银屑病的发病机制与遗传因素[3]、免疫异常[4,5]、炎症[6,7]、血管损伤[8]和精神神经因素[9]等具有一定相关性。目前临床治疗银屑病以激素及免疫抑制剂为主，长期服用此类药物可导致严重不良反应，故而受到限制[10]。中医学运用中药治疗银屑病由来已久，对缓解临床症状、延长疾病缓解期等具有一定优势[11]。

网络药理学是以计算机生物学、系统药理学等多学科理论为基础的探索药物与疾病关系的新兴学科[12],是对药物与人体综合作用的系统总结，具有系统性、层次性等特点，是对传统中药研究中单个小分子药物对应单个靶点治疗一种疾病模式的突破[13]。综合来看，网络药理学研究更加符合中医学的整体观和系统观，是对中药临床药理研究的一个补充。

银地消庀汤为笔者临床治疗银屑病的常用方剂，经临床验证有一定疗效，本研究将运用网络药理学方法，探究银地消庀汤治疗银屑病的潜在机制，并以分子对接加以验证，为后续进一步探究其作用机制提供理论基础，以期更好地将银地消庀汤运用于临床。

1、资料与方法

1.1 获取银地消庀汤活性成分及靶点

通过中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)搜寻银地消庀汤各药物的活性成分，筛选条件设置为口服生物利用度(OB)≥30%,类药性(DL)≥0.18,将所得结果导出至Excel表格。根据活性成分后的编号搜寻期对应的靶点，利用UniProt(http: //www.uniprot.or g/)数据库获得靶点基因名。并通过查阅文献补充未匹配到的基因名称。

1.2 获取银屑病靶点及共同靶点

以“Psoriasis”为关键词，在GeneCards、DisGent等数据库搜寻银屑病相关靶点，将各个数据库获得的靶点合并得到疾病靶点。利用Venny软件将活性成分对应靶点与疾病靶点取交集得到共同靶点，作为银地消庀汤治疗银屑病的潜在靶点，并绘制韦恩图。

1.3 构建“药物-活性成分-共同靶点”网络

利用Excel整理药物、活性成分、共同靶点等信息，制作“Network”文件和Type文件，导入Cytoscape 3.8.2软件，利用CytoNCA插件进行网络拓扑学分析，根据平均度值调整靶点的大小及透明度，构造“药物-活性成分-共同靶点”网络图。

1.4 构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络及拓扑分析

将交集基因导入STRING平台，置信度设置为0.900并隐藏游离基因节点，得到PPI网络，并导出其相关的信息文件。信息文件导入Cytoscape 3.8.2软件中，运用“Network Analyzer”计算网络拓扑学参数，筛选银地消庀汤治疗银屑病的关键靶点并绘图。

1.5 基因本体(GO)功能和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析

将共同靶点导入Metascape(http: //metascape.or g/)平台进行GO功能、KEGG通路富集分析，设置对象为“Human”,选择个性化分析，设置最小重叠为(Min Overlap)为3、P<0.05、最低浓缩度为1.5。得到结果后，制作GO功能气泡图和KEGG通路图。

1.6 分子对接

将核心靶点与其关联的活性成分进行分子对接。从RCSB PDB数据库(https: //www.rcsb.org/)下载靶点蛋白晶体结构，从TCMSP数据库(https: //old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)获得活性成分结构。运用用AutodockTools1软件对蛋白质晶体结构进行去水、加氢，并进行受体结构准备工作。使用Open Babel及Autodock 程序对活性成分进行拆分等准备工作并使用Autodock 程序进行分子对接，运用Pymol软件将对接结果可视化。

2、结 果

2.1 银地消庀汤活性成分及靶点

从TCMSP数据库及查阅文献，获取银地消庀汤的活性成分共248种，其中白花蛇舌草7种，白鲜皮18种，赤芍29种，大青叶10种，牡丹皮11种，甘草69种，槐花6种，黄芩36种，知母15种，紫草12种，金银花23种，生地黄8种，TCMSP数据库未收录生地黄，通过查阅文献，获得生地黄活性成分4种，其中OB值排名前20位的成分见表1。通过TCMSP数据库获取活性成分对应的靶点，经UniProt数据库注释获取标准基因名，删除重复项后获得靶点442个。

表1 中药成分表(OB值排前20位)

2.2 银屑病靶点及共同靶点

从GeneCards数据库获得疾病靶点4178个，DisGent数据库获得靶点1308个，OMIM数据库获得靶点23个，取合集并删除重复项后获得疾病靶点4481个，将疾病靶点与银地消庀汤靶点取交集，获得共同靶点219个，此部分靶点为银地消庀汤治疗银屑病的潜在靶点。(见图1)

2.3 “药物-活性成分-共同靶点”网络

利用Cytoscape 3.8.2构建“药物-活性成分-共同靶点”网络，该网络有635条边，3070个靶点。其中V字形代表中药，八边形代表活性成分，菱形代表共同靶点。其中英文缩写所代表药物为：BHSSC(白花蛇舌草)、BXP(白鲜皮)、CS(赤芍)、DQY(大青叶)、DP(牡丹皮)、GC(甘草)、HaiH(槐花)、HQin(黄芩)、ZM(知母)、ZC(紫草)、JYH(金银花)、SD(生地黄)。图中节点越大，颜色越深，代表其在网络中越重要。(见图2)

2.4 PPI网络及拓扑分析

运用Cytoscape 3.8.2软件筛选核心靶点，经“Network Analyzer”计算网络拓扑学参数，得到银地消庀汤治疗银屑病的核心靶点为转录因子AP-1(AP-1 Transcription Factor Subunit, JUN)、信号传导与转录激活因子3(STAT3)、核因子-κB P65蛋白(Nuclear Factor kappa B P65,RELA)、蛋白激酶B1(V-akt Murine Thymoma Viral Oncogene Homolog 1,AKT1)、热休克蛋白90α家族A级成员1(HSP90AA1)、肿瘤抑制蛋白53(TP53)、丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)等。(见图3)

图1 银地消庀汤和银屑病靶点韦恩图   

图2 药物-活性成分-共同靶点网络图  

图3 核心靶点图   

2.5 富集分析

2.5.1 GO功能富集分析

对核心靶点进行GO功能富集分析，生物过程(BP)方面，主要涉及对脂多糖的反应(Response to Lipopolysaccharide)、活性氧代谢过程(Reactive Oxygen Species Metabolic Process)等。细胞组分(CC)方面，主要与膜筏(Membrane Raft)、囊泡腔(Vesicle Lumen)等密切相关。分子功能(MF)方面，主要涉及核受体活性(Nuclear Receptor Activity)、配体激活的转录因子活性 (Ligand-Activated Transcription Factor Activity)等。(见图4)

图4 GO功能富集分析柱状图(排前30位)   

2.5.2 KEGG通路富集分析

为探究核心处方治疗银屑病所涉及的信号通路，对共同靶点进行KEGG通路富集分析，共涉及270条通路。主要涉及脂质与动脉粥样硬化(Lipid and Atherosclerosis)、流体剪切应力和动脉粥样硬化(Fluid Shear Stress and Atherosclerosis)、肿瘤坏死因子(TNF)信号通路、白细胞介素-17(IL-17)信号通路等。(见图5～7)

图5 KEGG通路富集分析弦图   

图6 信号通路网状图(排前10位)   

图7 KEGG通路富集分析柱状图(排前20位)   

2.6 分子对接

分子对接结合热能小于-1 kcal/mol表示具有结合活性，小于-5kcal/mol表示结合活性较好。选择核心靶点AKT1、RELA、STAT3、TP53与其对应的成分进行对接，各靶点与其对应的成分对接结合能均小于-5,活性蛋白口袋能较好地包裹小分子。(见表2、图8)

表2 分子对接的结果

图8 分子对接图结果集合图   

3、讨 论

中医学并无“银屑病”的病名，多将其归纳到“白庀”“干癣”“蛇虱”“庀风”“松皮癣”等范畴。《外科大成》云：“白庀，肤如疹疥，色白而痒，搔起白庀，俗称蛇虱，由风邪客于皮肤，血燥不能荣养所致。”《外科证治全书》又云：“白庀，一名庀风，皮肤燥痒，起如疹疥而色白，搔之屑起，渐至肢体枯燥拆裂，血出痛楚，十指间皮厚而莫能搔痒。”本病有一定的季节性，多在深秋干燥时节发作。

综合历代医家对银屑病的认识，大致可分为血热、血燥两型论治[14,15],临床所见一般又多兼夹湿毒之邪[16]。结合笔者自身体会，对于血热类型患者采取清热祛湿凉血解毒之法治疗，往往能取得较好的临床疗效。银地消庀汤是笔者治疗银屑病的常用处方，由白花蛇舌草、白鲜皮、赤芍、大青叶、牡丹皮、甘草、槐花、黄芩、知母、紫草、金银花、生地黄共12味中药组成。其中黄芩苦寒，能祛中上焦湿热，泻火解毒，白花蛇舌草入胃及大、小肠经，清解湿热之毒，引之从下焦而走，二药相合，清利三焦湿热；金银花甘寒入肺经，能疏能散，清解肺卫热毒，大青叶入心经，擅清热毒，凉血化斑，白鲜皮归脾、胃、膀胱经，能清湿热，祛风毒，热毒在上，疏而散之，热毒在中，清而化之，热毒在下，导而泄之，表里同治，脏腑并行，热毒得解；牡丹皮性微寒味苦、辛，寒以凉血，辛以化瘀，赤芍味苦微寒，能凉血解毒化瘀，使凉而不滞；知母、生地黄性寒味甘、苦，甘能滋能补，苦能渗能泻，甘以滋阴，苦以清热，二药相合，能清血热而养阴津；槐花、紫草凉血止血，辅以甘草调和药性；诸药合用，共奏清热祛湿、凉血解毒之功，切中银屑病证属血热湿毒证者病机。

通过本研究中的中药-活性成分-靶点网络分析可知，银地消庀汤治疗银屑病所涉及的主要活性成分有γ-氨基丁酸(Gamma-Aminobutyric Acid)、槲皮素(Quercetin)、山柰酚(Kaempferol)、木犀草素(Luteolin)、菜豆异黄素(Phaseolinisoflavan)、甘草查耳酮A(Licochalcone A)等。槲皮素是广泛存在于多种植物中的类黄酮，具有抗炎、抗氧化等作用[17]。研究表明，槲皮素可能通过抑制核因子κB(NF-κB)信号通路[18],降低咪喹莫特诱导的银屑病小鼠血液白细胞介素-6、白细胞介素-17等炎症因子水平，同时降低小鼠银屑病样病变皮肤的温度，一定程度地阻止病变皮肤组织的进一步恶化[19]。另有研究表明，槲皮素能抑制肠道中内毒素的吸收，缓解内毒素血症，从而延缓银屑病的发生发展[20]。山柰酚是天然黄酮醇，存在于多种植物中，具有良好的抗炎、抗氧化和抗癌特性[21]。研究表明，山柰酚能抑制银屑病小鼠白细胞介素-17、肿瘤坏死因子α(TNF-α)等炎症因子RNA的表达[22],在体外抑制T细胞增殖并下调哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路，从而降低炎症因子水平，减轻免疫细胞浸润，改善银屑病皮损、抑制表皮增生缓解病情[23]。另有研究表明，山柰酚能调节免疫系统，抑制Th17的功能，同时增强调节性T细胞(Treg)中特异性叉头状转录因子3(Foxp3)蛋白水平的表达水平，减轻免疫细胞浸润而发挥治疗作用[24]。木犀草素属于类黄酮，广泛存在于花卉、草药、蔬菜和香料中。研究显示，木犀草素可促进人表皮干细胞的增殖和迁移，促进皮肤的自我更新及修复[25],进一步的研究也证实了这种能力可能与降低血管内皮生长因子(VEGF)的表达，抑制mTOR信号通路有关[26,27]。研究表明，木犀草素能抑制γ干扰素的作用，减少热休克蛋白90(Hsp90)的表达[28],调节免疫系统，从而减轻银屑病的皮损和症状。另有研究表明，木犀草素能通过阻断NF-κB信号通路，降低白细胞介素-6、白细胞介素-23等炎症因子及炎症介质的水平，减轻巨噬细胞、T细胞的浸润，改善银屑病小鼠病灶处脱屑、红斑等症状[29]。综上所述，银地消庀汤中的多种成分可能通过抗炎、抗氧化、调节免疫等多种途径发挥治疗银屑病的作用。

由PPI网络可知，银地消庀汤治疗银屑病的核心靶点为JUN、STAT3、RELA、AKT1、HSP90AA1、TP53、MAPK1等。STAT3与银屑病的发生、发展密切相关，能在不同的细胞类型中激活不同的基因组而产生不同的作用，STAT3是激活辅助性T细胞17(Th17)增殖、分化的关键基因，介导参与了白细胞介素-23、白细胞介素-21等与Th17细胞功能密切相关的细胞因子的信号传导，同时在炎症期间，它还能维护T细胞亚群的稳态并促使其扩增[30]。在角化细胞中，STAT3介导参与了白细胞介素-22等细胞因子的激活导致银屑病病灶表皮的分化减少、增殖增加和棘层肥厚，同时STAT3介导的白细胞介素-19参与放大白细胞介素-23/白细胞介素-17轴，诱导促炎介质形成[31]。研究表明，RELA染色分级与银屑病病灶表皮增生程度及炎症浸润显著相关，是银屑病发生、发展的关键靶点[32]。AKT1属于蛋白激酶B家族，研究表明银屑病患者体内Akt-FOXO1通路失调会引起Treg功能失常，加重病情[33]。

GO功能富集分析结果显示，BP方面，富集最显著的条目主要与氧化应激、细胞增殖、凋亡、炎症反应有关，与银屑病的病因、病理相契合。CC方面，主要与膜筏、囊泡腔等密切相关。MF方面，主要涉及核受体活性、配体激活的转录因子活性等，涉及的靶点有JUN、 STAT3、RELA、AKT1、MAPK1等，主要与炎症调节、免疫调节有关。对核心靶点进行KEGG通路富集分析，主要涉及脂质与动脉粥样硬化、流体剪切应力和动脉粥样硬化、TNF信号通路、白细胞介素-17信号通路。

脂质代谢失衡是导致银屑病的重要因素之一，瘦素、脂联素作为脂肪因子参与并调节机体脂质代谢过程[34]。研究显示，瘦素可刺激机体内白细胞介素-1Rα的表达，诱导体内诸如白细胞介素-6、TNF-α等一系列促炎因子的释放，激活NF-κB、STAT3和MAPK等信号通路，可以调节巨噬细胞活化，以此来影响银屑病的发展及转归[35]。进一步研究发现，对于过度肥胖的银屑病患者而言，其脂肪中的瘦素呈现过表达状态，这可能引起双调蛋白水平升高，进而导致促角质形成细胞大量增殖，导致病情加重[36]。研究显示，脂联素可通过与细胞表面脂联素相关受体结合影响Th17细胞的增殖、分化，诱发或加重银屑病[37]。TNF与其对应的2种受体TNF-R1和TNF-R2相互作用，可促进机体内炎症因子的释放，参与了免疫反应、炎症调节等过程，而TNF信号通路长期的激活能增强Treg的功能，促进其增殖，从而限制过度炎症，能够有效缓解银屑病[38]。此外，临床研究还发现使用TNF抑制剂可从一定程度上改善银屑病，同时还具有减轻患者的心血管事件风险的作用[39,40]。白细胞介素-17由Th17产生，通常与白细胞介素-23联动反应，参与一系列的免疫反应及促炎反应[41],银屑病患者受到环境刺激会激活免疫系统，使Th17极化、克隆扩增，皮肤中活化的Th17会产生包括白细胞介素-17、TNF-α和白细胞介素-26 等多种细胞因子[42]。银屑病中的主要效应细胞因子白细胞介素-17单独作用或与 TNF-α协同作用，诱导角质形成细胞表达和释放许多银屑病相关蛋白[43]。此外，白细胞介素-17通过白细胞介素-22、白细胞介素-19和白细胞介素-36等细胞因子放大角质形成细胞的炎症、免疫反应，促进表皮增生，使病灶皮肤增厚、鳞状化[44]。

综上所述，银地消庀汤中γ-氨基丁酸、槲皮素、山柰酚、木犀草素等成分作用于JUN、 STAT3、RELA、AKT1等靶点，调节脂质与动脉粥样硬化、TNF信号通路、白细胞介素-17信号通路而发挥治疗银屑病的作用。本研究通过网络药理学和分子对接初步探究了银地消庀汤治疗银屑病的潜在机制，下一步我们将继续通过动物实验及体外细胞实验对上述结果进行验证。

参考文献:

[1]中华中医药学会皮肤科分会.皮肤科分会银屑病中医治疗专家共识(2017年版)[J].中国中西医结合皮肤性病学杂志,2018,17(3):273-277.

[2]中华医学会皮肤性病学分会银屑病专业委员会.中国银屑病诊疗指南(2018完整版)[J].中华皮肤科杂志,2019,52(10):667-710.

[3]刘晋,沈征宇.银屑病表观遗传调控的研究进展[J].中华皮肤科杂志,2022,55(9):825-829.

[4]肖春英,王刚.朗格汉斯细胞在银屑病中的作用研究进展[J].中华皮肤科杂志,2022,55(9):830-834.

[5]赵思琪,苏日娜,何焱玲.CGRP在银屑病神经免疫中的作用[J].国际免疫学杂志,2022,45(3):294-298.

[6]王生,刘洋,张晶.川芎嗪调控NF-κB信号通路对银屑病HaCaT细胞模型趋化因子和炎症因子表达影响[J].中国免疫学杂志,2022,38(8):952-957.

[7]李鹏远,郭海霞,白朝,等.进展期寻常型银屑病患者血清YKL-40水平变化及临床意义[J].山东医药,2020,60(16):22-25.

[8]李宁飞,王燕,赵京霞,等.活血解毒方对银屑病小鼠血管增殖以及炎症因子的干预作用[J].北京中医药大学学报,2019,42(4):296-303.

[9]高祎濛,晋红中.精神神经因素在银屑病发病中的作用[J].中华皮肤科杂志,2019,52(3):204-207.

[10]王召阳,徐子刚.生物制剂在儿童银屑病治疗中的应用进展[J].中国皮肤性病学杂志,2022,36(1):108-112.

[11]朱杨壮壮,董文馨,邹纯朴,等.基于“肺主皮毛”理论探讨银屑病与肺癌共病免疫机制[J].中华中医药杂志,2022,37(5):2813-2819.

[12]解静,高杉,李琳,等.网络药理学在中药领域中的研究进展与应用策略[J].中草药,2019,50(10):2257-2265.

[13]任艳,邓燕君,马焓彬,等.网络药理学在中药领域的研究进展及面临的挑战[J].中草药,2020,51(18):4789-4797.

基金资助:江西省教育厅2022年度一般项目(GJJ2200936);

文章来源:马非,薛松.基于网络药理学及分子对接探讨银地消庀汤治疗银屑病的潜在机制[J].湖南中医杂志,2023,39(12):165-173.