鱼腥草芩蓝合剂为浙江惠松制药有限公司生产的中成药品种，其中君药为鱼腥草，臣药为连翘、金银花，佐药为黄芩、板蓝根。该制剂中的君药鱼腥草具有清热解毒、消痈排脓、利尿通淋等功效，现代研究表明鱼腥草有抗病毒、抗炎、增强机体免疫等药理活性，对咽喉炎、慢性支气管炎、肺炎、呼吸道感染等均有一定疗效[1]。该制剂的主要功效为清热解毒，多用来治疗外感风热所致咽喉肿痛和急性咽炎、扁桃体炎等[2]。相关研究表明，该制剂对小儿疱疹性咽峡炎引起的发热、咽痛、拒食、疱疹等症状有较好疗效[3]。鱼腥草芩蓝合剂的现行标准[WS3-1072 (Z-274)-2007Z-2011]中仅规定了金银花、黄芩、鱼腥草、连翘的鉴别及黄芩苷的含量测定，目前关于该制剂含量测定的研究文献较少，仅有邓茂芳等[4]测定了其中绿原酸、黄芩苷和黄芩素的含量，昝珂等[5]建立了其中黄芩苷等7种成分的HPLC色谱法。本实验在前期研究的基础上，建立了鱼腥草芩蓝合剂HPLC指纹图谱，并对黄芩苷、汉黄芩苷、汉黄芩素、连翘苷、连翘酯苷A、绿原酸、芦丁和槲皮苷的含量进行了同时测定，以期对今后鱼腥草芩蓝合剂相关质量标准的提升提供依据。

1、仪器与试药

1.1 仪器

安捷伦1200系列高效液相色谱仪(美国Aligent公司);KQ-310E型实验室用台式超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司);明澈-D24UV纯水系统(美国密理博公司);AR224CN电子天平(奥豪斯仪器[上海]有限公司，感量：0.01 mg)。

1.2 试药

绿原酸(批号PS016094,纯度99.34%)、连翘酯苷A(批号PS011807,纯度99.39%)、芦丁(批号PS012233,纯度99.51%)、汉黄芩苷(批号PS011072,纯度99.85%)、槲皮素(批号PS012093,纯度99.94%)、连翘苷(批号PS012094,纯度99.66%)、槲皮苷(批号PS011840,纯度99.17%)、黄芩苷(批号PS011768,纯度98.90%)、汉黄芩素(批号PS011541,纯度99.30%)对照品均购自成都普思生物科技股份有限公司。甲醇(色谱纯，美国天地公司);水为超纯水；磷酸(分析纯，杭州高晶精细化工有限公司)。鱼腥草芩蓝合剂(浙江惠松制药有限公司，国药准字Z20030033),共17批(编号S1-S17,批号分别为201006、201108、201110、201112、201117、201202、210110、210717、210909、211006、220312、220314、220315、220317、220319、220321、220322),均由浙江惠松制药有限公司提供。

2、方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为岛津SHIMSEM Ankylo C18液相色谱柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm);流动相采用0.1%磷酸溶液(A)-甲醇(B),梯度洗脱(0～15 min),20%～30% B;15～25 min, 30%～40% B;25～40 min, 40% B;40～50 min, 40%～55% B;50～55 min, 55%～65% B;55～60 min, 65%～80% B;60～62 min, 80% B;62～65 min, 80%～20% B;65～75 min, 20% B;检测波长为210 nm; 柱温为40 ℃;体积流量为1.0 mL/min; 进样量为10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液制备

对各对照品进行精密称定，以75%甲醇溶解制成黄芩苷、汉黄芩苷、汉黄芩素、连翘苷、连翘酯苷A、绿原酸、芦丁、槲皮苷的质量浓度分别为0.280 2、0.096 1、0.009 0、0.014 8、0.014 8、0.019 9、0.006 5、0.008 1 mg/mL的溶液，过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.2.2 指纹图谱供试品溶液

取各批次鱼腥草芩蓝合剂样品，过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.2.3 含量测定供试品溶液

精密量取各批次鱼腥草芩蓝合剂样品5 mL,置于25 mL容量瓶中，向其中加入15 mL 的75%甲醇溶液，超声30 min后将样品取出，放冷，再用75%甲醇稀释至刻度，过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.2.4 阴性样品溶液制备

依照鱼腥草芩蓝合剂的处方和有关工艺要求，分别制备缺鱼腥草、连翘、金银花、板蓝根及黄芩的阴性样品溶液，过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.3 HPLC指纹图谱建立

2.3.1 精密度试验

取本合剂样品(批号：211006),依照“2.2.2”项中描述的方法，制得指纹图谱精密度试验用供试品溶液，依照“2.1”项中描述的色谱条件进样测定6次，把17号峰(黄芩苷)作为参照峰，试验最终测得每个共有峰的相对保留时间RSD在0.04%～0.47%之间，相对峰面积RSD在0.04%～1.29%之间，试验结果表明仪器精密度良好。

2.3.2 稳定性试验

取鱼腥草芩蓝合剂样品(批号：211006),依照“2.2.2”项中描述的方法，制得指纹图谱稳定性试验用供试品溶液，依照“2.1”项中描述的色谱条件分别在0、2、4、8、12、24 h共6个时间点进样测定，把17号峰(黄芩苷)作为参照峰，试验最终测得各共有峰的相对保留时间RSD在0.25%～1.15%之间，相对峰面积RSD在0.07%～1.87%之间，试验结果表明该供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.3 重复性试验

取鱼腥草芩蓝合剂样品(批号：211006),共6份，依照“2.2.2”项中描述的方法，分别制得指纹图谱重复性试验用供试品溶液，依照“2.1”项中描述的色谱条件进样测定，把17号峰(黄芩苷)作为参照峰，试验最终测得各共有峰的相对保留时间RSD在0.03%～0.23%之间，相对峰面积RSD在0.08%～1.86%之间，试验结果表明该方法重复性良好。

2.4 指纹图谱建立及分析

2.4.1 指纹图谱建立及其相似度评价

取17批鱼腥草芩蓝合剂样品(S1-S17),依照“2.2.2”项中描述的方法，制得指纹图谱供试品溶液，依照“2.1”项中描述的色谱条件进样测定，将所需要的色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版)”中，时间窗宽度0.3 min, 参照图谱为样品S10(批号：211006)的HPLC图谱，共标定27个共有峰，中位数法生成指纹图谱共有模式(R),见图1。17号峰(黄芩苷)峰面积较大，保留时间居中，且波动小，性质稳定，因此将其作为参照峰。各批样品指纹图谱与对照图谱的相似度均>0.990,比对情况，见表1。

图1 17批鱼腥草芩蓝合剂HPLC指纹图谱  

表1 指纹图谱相似度

2.4.2 共用峰归属及化学成分指认

取“2.2.1”项下对照品溶液及“2.2.4”项下阴性样品溶液，按“2.1”项下色谱条件分析，结果见图2、图3。比对图2对照品溶液色谱图，可知4号峰为绿原酸，10号峰为连翘酯苷A,11号峰为芦丁，14号峰为槲皮苷，15号峰为连翘苷，17号峰为黄芩苷，21号峰为汉黄芩苷，25号峰为汉黄芩素。由图3阴性样品溶液色谱图可知，峰12、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27归属于黄芩，峰3、6归属于金银花，峰7、9、10、11、15归属于连翘，峰14归属于鱼腥草。以17号峰(黄芩苷)为参照，测得共有峰相对保留时间在0.08%～0.77%之间，相对峰面积RSD在2.77%～29.30%之间，表明不同批次样品所含成分种类差别不大，但其含量还是有一定差异。

图2 对照品溶液HPLC色谱   

图3 阴性样品溶液HPLC色谱   

2.4.3 聚类分析

以17批鱼腥草芩蓝合剂中27个共有峰的峰面积为变量，应用SPSS 26.0软件，使用组间联接法、平方欧式距离法绘图，结果见图4。分析结果可知，17批样品聚为5类，第1类为S1,第2类为S2、S3、S4、S8、S9,第3类为S5、S6、S7、S10,第4类为S11、S12、S13,第5类为S14、S15、S16、S17。聚类分析结果表明，不同批次样品因药材批次不同等原因，其共有成分的含量存在组间差异。

2.4.4 主成分分析

应用SPSS 26.0软件进行主成分分析，分析后从中提取特征值都>2的3个主成分，3个主成分的累积方差贡献率合计为75.804%,说明这3个主成分可代表图谱中每个成分相关的大部分信息，结果见表2。载荷矩阵和载荷图可反映各变量对主成分的综合贡献，结果见表3、图5。可知色谱峰2、3、8、10(连翘酯苷A)、12、22、27对主成分1的贡献率较大，色谱峰15(连翘苷)、18对主成分2的贡献率较大，色谱峰16对主成分3的贡献率较大。以上结果提示在鱼腥草芩蓝合剂的生产过程中需要重点关注以上成分的变化。

图4 17批鱼腥草芩蓝合剂的聚类分析   

表2 主成分特征值及方差贡献率

表3 主成分因子载荷矩阵

图5 主成分因子载荷   

2.5 含量测定

2.5.1 专属性试验

依照“2.2.3”项中描述的方法，对供试品溶液进行制备，依照“2.1”项中描述的色谱条件进样测定，结果见图6。各成分分离度良好，合剂中其他共存物质对测定结果无干扰，理论塔板数以17号峰(黄芩苷)计算不得低于10 000。

图6 含量测定供试品溶液HPLC谱   

2.5.2 线性关系考察

取依照“2.2.1”项中描述的方法制备的对照品溶液，依照“2.1”项中描述的色谱条件进样测定，进样量分别为1、2、4、10、15、20 μL,横坐标(X)是对照品的质量浓度，纵坐标(Y)是测得的峰面积，通过线性回归，可以看出各成分在各自的范围内线性关系良好。见表4。

表4 各成分线性关系

2.5.3 精密度试验

取依照“2.2.1”项中描述的方法制备的对照品溶液，依照“2.1”项中描述的色谱条件进样6次测定，最终测定结果如表5所示。试验结果表明仪器精密度良好。

2.5.4 稳定性试验

取鱼腥草芩蓝合剂样品(批号：211006)1份，依照“2.2.3”项中描述的方法，对稳定性试验所需的供试品溶液进行制备，依照“2.1”项中描述的色谱条件分别在0、2、4、8、12、24 h共6个时间点进样测定，最终测定结果如表5所示。试验结果表明此合剂供试液溶液在24 h内稳定性良好。

2.5.5 重复性试验

取鱼腥草芩蓝合剂样品(批号：211006)6份，依照“2.2.3”项中描述的方法，对重复性试验所需的供试品溶液进行制备，依照“2.1”项中描述的色谱条件进样测定，最终测定结果如表5所示。试验结果表明该HPLC方法重复性良好。

表5 精密度、稳定性和重复性试验结果

2.5.6 加样回收率试验

取鱼腥草芩蓝合剂样品(批号：211006)6份，每份各5 mL,将其置于50 mL的容量瓶中，分别精密加入75%甲醇溶解的混合对照品溶液(黄芩苷、汉黄芩苷、汉黄芩素、连翘苷、连翘酯苷A、绿原酸、芦丁、槲皮苷的质量浓度分别为1.066 1、0.207 5、0.020 5、0.025 0、0.083 5、0.015 2、0.003 4、0.009 1 mg/mL)10 mL,75%甲醇15 mL,超声30 min后将样品取出，放冷，再分别用75%甲醇定容至刻度，依照“2.1”项中描述的色谱条件进样测定，计算得出加样回收率，结果见表6。黄芩苷、汉黄芩苷、汉黄芩素、连翘苷、连翘酯苷A、绿原酸、芦丁、槲皮苷的平均加样回收率分别为101.71%、98.42%、99.00%、98.74%、96.92%、103.53%、97.92%、96.17%,RSD分别为0.68%、1.21%、0.58%、0.51%、0.50%、0.88%、0.99%、1.23%。试验结果表明该HPLC方法的加样回收率良好。

2.5.7 样品含量测定

取17批本合剂样品(S1-S17),依照“2.2.3”项中描述的方法进行供试品溶液的制备，依照“2.1”项中描述的色谱条件进样测定，最终计算得出17批鱼腥草芩蓝合剂样品中各成分的含量，结果见表7。鱼腥草芩蓝合剂中黄芩苷、汉黄芩苷、汉黄芩素、连翘苷、连翘酯苷A、绿原酸、芦丁和槲皮苷的含量分别为1.918～2.643 mg/mL、0.331～0.523 mg/mL、0.022～0.051 mg/mL、0.035～0.124 mg/mL、0.085～0.201 mg/mL、0.024～0.057 mg/mL、0.007～0.016 mg/mL和0.007～0.046 mg/mL。

表6 加样回收率试验结果

表7 17批鱼腥草芩蓝合剂的含量测定结果

3、讨论

3.1 色谱条件优化

3.1.1 流动相

本实验对甲醇-0.1%磷酸、甲醇-0.2%磷酸以及乙腈-0.1%磷酸共3个流动相系统进行了研究，结果显示当甲醇-0.1%磷酸作为流动相时，所得到的色谱峰峰形是三者中最好的，分离效果也是三者中最好的。

3.1.2 检测波长选择

文献报道黄芩苷的紫外最大吸收波长为277 nm, 汉黄芩苷为274 nm, 汉黄芩素为276 nm[6],连翘苷为277 nm, 连翘酯苷A为330 nm, 绿原酸为327 nm[7],芦丁为370 nm[8],槲皮苷为349 nm[9]。本实验比较了210、277、320 nm波长处的色谱图，结果表明227 nm和320 nm下色谱峰的信息较少，不能反映鱼腥草芩蓝合剂的全部色谱峰信息，而210 nm检测波长下色谱峰信息量较大，且条件稳定，色谱峰分离效果好，因此选择210 nm作为测定波长。

3.1.3 指标成分的选择

鱼腥草芩蓝合剂中所含的黄芩苷、汉黄芩苷、汉黄芩素、连翘苷、连翘酯苷A、绿原酸、芦丁和槲皮苷等8种成分有抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、解热、镇痛、调节免疫等药理作用[10,11,12,13,14,15,16,17],均在该中成药中发挥抗病毒、止痛、调节免疫等作用，是治疗外感风热引起的咽喉肿痛、急性咽炎、扁桃体炎等症状的有效成分[3,4],因此本研究选择上述8种成分作为指标成分。

3.2 样品测定分析

本实验检测的8种成分中黄芩苷、汉黄芩苷、汉黄芩素主要来自于药材黄芩，连翘苷和连翘酯苷A主要来自药材连翘，芦丁和槲皮苷主要来自药材鱼腥草，绿原酸主要来自于药材鱼腥草和金银花。含量测定结果显示，鱼腥草芩蓝合剂中黄芩苷和汉黄芩苷的含量较高，而汉黄芩素、连翘苷、连翘酯苷A、绿原酸、芦丁和槲皮苷的含量较低。8种成分中连翘酯苷A和槲皮苷的含量差异较大，可能与不同批次样品中使用了不同批次的连翘和鱼腥草药材有关。根据文献报道，连翘的生产环境、采收期、加工方式[18]、产地[19]、颜色[20],鱼腥草的不同部位[21]、生产环境[22]、产区[23]等都会对连翘和鱼腥草中成分的含量产生影响。因此，在生产过程中要重点关注药材的质量，以保证制剂质量的一致性和稳定性。

4、结语

本研究建立了鱼腥草芩蓝合剂高效液相指纹图谱，通过对17批该中成药的进样分析，以黄芩苷作为参照峰，确定了鱼腥草芩蓝合剂的特征图谱，标定了27个共有峰；通过对照品比对，确认4号峰为绿原酸，10号峰为连翘酯苷A,11号峰为芦丁，14号峰为槲皮苷，15号峰为连翘苷，17号峰为黄芩苷，21号峰为汉黄芩苷，25号峰为汉黄芩素；27批鱼腥草芩蓝合剂相似度均在0.990以上，表明该合剂生产工艺稳定，但不同批次样品中各成分含量有一定差异；化学计量学研究结果显示，鱼腥草芩蓝合剂分为5类，主成分分析提取得到的3个主成分能代表75.804%的共有峰信息，表明不同批次样品存在一定的差异性。通过对鱼腥草芩蓝合剂中的黄芩苷、汉黄芩苷、汉黄芩素、连翘苷、连翘酯苷A、绿原酸、芦丁和槲皮苷等8种成分进行含量测定，发现该中成药中黄芩苷和汉黄芩苷的含量较高，而汉黄芩素、连翘苷、连翘酯苷A、绿原酸、芦丁和槲皮苷的含量较低。研究结果表明，本研究所用含量测定方法简便准确，重复性、稳定性良好，适用于鱼腥草芩蓝合剂中8种成分的含量测定，可为其质量控制提供参考。

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基金资助:浙江省自然科学基金(LY21H280001);浙江省教育厅一般科研项目(Y201840594); 杭州市农业与社会发展科研项目(20201203B130);

文章来源:温浩,郑致远,张杰,等.鱼腥草芩蓝合剂HPLC指纹图谱及8种成分含量测定[J].亚太传统医药,2024,20(04):20-26.