脑缺血/再灌注(cerebral ischemia/reperfusion, CI/R)损伤是由于脑卒中后再灌注引起的脑组织细胞功能障碍，进而造成脑神经损伤及脑功能受损。若不及时干预可能会导致患者脑组织持续性缺血，严重者会导致患者死亡[1]。目前临床治疗CI/R损伤的效果并不理想，CI/R损伤药物的研发仍是当前医学研究热点之一[2]。中医药作为脑卒中临床治疗的重要组成部分独具优势和特色，其对CI/R损伤的防治作用也备受医家的关注[3]。

中医认为脑卒中的病机是“气虚血瘀”,“气虚”是发病之本，“血瘀”是发病之核心。气虚，血运行无力，则致血瘀，故“补气、活血、祛瘀”被视为脑卒中的治疗原则[4]。首届国医大师邓铁涛教授将黄芪、丹参作为药对配伍用于活血、化瘀、补气的经验方[5]。黄芪为补气之王，能益气补虚，丹参为调理血分之首，偏于活血化瘀。黄芪得丹参相佐，生新而不留瘀；丹参得黄芪之助，活血之力倍增，两药配伍，协同增效、相得益彰。现代医学研究显示，黄芪、丹参能增加心肌收缩力，有效防止循环衰竭，还能降低血压，缓解肢体肿胀，改善心绞痛症状，也具有保护肝脏、增强机体免疫力的功效[6,7,8,9]。

本研究主要观察黄芪-丹参对CI/R损伤小鼠的脑保护作用及其对氧化应激的影响，以期推动黄芪-丹参药对的现代化开发，并为其临床合理应用提供循证医学支撑。

1、材料

1.1 动物

清洁级健康C57BL/6雄性小鼠72只，体质量(20±1) g, 购自陕西中医药大学实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK(陕)2021-001,实验动物使用许可证号：SYXK(陕)2021-001。所有小鼠饲养于陕西中医药大学协同创新中心，室温(23±1)℃,湿度45%～55%,光照时间为12 h, 昼夜交替循环。本实验经陕西中医药大学实验动物伦理委员会批准，伦理审批编号：SUCMDL20230620003。

1.2 药物与试剂

黄芪、丹参配方颗粒(广东一方制药有限公司，批号：1039052、1070582);丹红注射液(山东步长制药有限公司，批号：21082002);2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride, TTC)试剂盒、髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，货号：G3005、SEKM-0118);HE染色试剂盒(武汉赛维尔生物科技有限公司，货号：GP1031);活性氧检测试剂盒(dihydroethidium-reactive oxygen species, DHE-ROS)(上海贝博生物科技公司，货号：BB-47051);超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)试剂盒、丙二醛(malondialdehyde, MDA)试剂盒、组织裂解液(碧云天生物科技有限公司，货号：S0088、S0131S、P0013F);核因子E2相关性因子2(nuclear factor E2 related factor 2,Nrf2)、血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)、GAPDH、山羊抗兔IgG抗体(赛默飞世尔科技有限公司，货号：PA5-88084、PA5-77833、MA1-16757、31430)。

1.3 仪器

台式高速冷冻离心机(贝克曼库尔特中国有限公司，型号：Allegra X-15R);电子旋转切片机(赛默飞世尔科技有限公司，型号：HM340E);石蜡包埋机(东莞市谱标实验器材科技有限公司，型号：SPCC-6D);倒置荧光显微镜(日本OLYMPUS公司，型号：IX83/IX73);酶标仪(美谷分子仪器上海有限公司，型号：SpectraMax iD5);伯乐凝胶成像分析仪(美国Bio-rad公司，型号：Gel DocEZ)。

2、方法

2.1 CI/R损伤模型制备

小鼠禁食12 h, 10%水合氯醛进行麻醉，将其仰卧位固定，颈部作一“V”型切口，钝性分离组织，暴露右侧颈总动脉(common carotid artery, CCA)、颈内动脉(internal carotid artery, ICA)及颈外动脉(external carotid artery, ECA)。采用丝线结扎ECA根部和CCA近心端，并用动脉夹夹闭ICA。在CCA结扎处与三叉口之间作“V”形切口，将线栓光滑端自切口轻轻插入，从血管切口处开始计算，深度为18～20 mm。脑缺血2 h后，拔线栓进行再灌注24 h。CI/R损伤模型建立成功的标志是小鼠苏醒后出现右眼Horner征(梗死灶同侧眼睑下垂、眼球内陷),提尾时左前肢内收屈曲，行走时向左侧转圈或倾倒[10]。

2.2 分组及给药

将72只小鼠随机分为假手术组、模型组、黄芪-丹参低剂量组、黄芪-丹参中剂量组、黄芪-丹参高剂量组及丹红注射液组，每组12只，其中6只用于Longa 5评分和TTC染色实验，另外6只用于ELISA、Western blot、HE染色和DHE-ROS实验。黄芪(临床常用剂量18～30 g)和丹参(临床常用剂量10～15 g)以1：1的比例配伍，按照人与小鼠体表面积计算黄芪-丹参药对的给药剂量约为3 g·kg-1[11],由此设置黄芪-丹参低剂量、中剂量、高剂量分别为1.5 g·kg-1、3 g·kg-1、6 g·kg-1。丹红注射液的给药剂量为10 mg·kg-1[12],假手术组和模型组给予生理盐水灌胃(10 mL·kg-1),每日1次，连续7 d。末次给药后，假手术组只行手术，不进行结扎和线栓操作；其余小鼠采用“2.1”项方法进行造模。

2.3 样本制备

造模后，10%水合氯醛麻醉小鼠，断头取全脑，将分离出的大脑迅速置于低温PBS冰水混合物冲洗，随后在-20 ℃冰箱冷冻10 min后取出；全脑行冠状切片，厚度1.0 mm, 共切成6片，-80 ℃ 保存用于TTC染色。同法分离大脑后，沿中线取缺血半球侧大脑，-80 ℃保存用于ELISA、Western blot实验；4%多聚甲醛溶液固定，4 ℃保存用于HE染色、DHE-ROS实验。

2.4 Longa 5分法评价小鼠神经功能

采用单盲法进行小鼠神经功能损伤评分，具体标准为：没有神经损伤症状(0分);提尾时梗死对侧前肢屈曲(1分);行走时向对侧旋转(2分);身体向对侧倾倒(3分);不能独立行走或意识丧失(4分)[13]。

2.5 TTC染色法检测小鼠脑梗死面积

将制备的脑组织切片放入2% TTC染色液中，37 ℃避光孵育30 min, 孵育过程中需要翻动脑片以确保染色均匀。染色完成后，取出脑片，PBS洗涤5 min, 最后拍照并进行图像分析。

脑梗死面积百分比=[对侧脑半球面积-(缺血脑半球面积-梗死面积)/对侧脑半球面积]×100%

2.6 HE染色观察小鼠脑组织缺血区域病理形态

各组随机选取3只小鼠进行检测，取4%多聚甲醛溶液固定的脑组织，石蜡包埋后进行切片(厚度 5 μm),随后烘烤1 h, 二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，常规苏木精-伊红染色，二甲苯透明，中性树脂封片，光学显微镜下观察脑组织缺血区域的病理形态并拍照。

2.7 DHE-ROS法检测小鼠脑组织缺血区域ROS水平

各组随机选取3只小鼠进行检测，取4%多聚甲醛溶液固定的脑组织，蔗糖脱水后，加OCT包埋剂到组织周围，静置10 min, 将组织按照切片方向置于新包埋盒底部，迅速置于干冰与乙醇的混合物中，冰冻切片机下行组织切片(厚度 8 μm)。取冰冻切片室温复温30 min, DHE-ROS溶液避光浸泡30 min, PBS冲洗切片，在荧光显微镜下观察，ROS阳性表现为较强的红色荧光。

2.8 ELISA检测小鼠脑组织缺血区域MPO、SOD、MDA含量

根据ELISA试剂盒的说明书进行操作，使用酶标仪在450 nm波长下测定光密度(optical density, OD)值，绘制标准曲线，进而计算MPO、SOD、MDA含量。

2.9 Western blot检测小鼠脑组织缺血区域Nrf2、HO-1蛋白表达水平

各组随机选取3只小鼠脑组织进行检测，使用含蛋白酶抑制剂的组织裂解液研磨匀浆，低温离心8 min(12 000 r·min-1),取上清；采用BCA法检测总蛋白含量，取30 μg蛋白样本上样，用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移到PVDF膜；5%牛血清白蛋白封闭1 h; 加入Nrf2、HO-1、GAPDH抗体(1：1 000),4 ℃孵育过夜；TBST清洗3次，每次10 min; 加入山羊抗兔IgG(1：2 000),室温孵育1 h, TBST清洗3次；配置ECL化学发光液，智能凝胶成像系统下曝光并拍照，Image J软件分析蛋白条带灰度值，并计算目的蛋白的相对表达量。

2.10 统计学方法

采用GraphPad Prism软件分析数据，计量资料以均数±标准差表示。若数据服从正态分布，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析以及Tukey多重比较检验；若数据不服从正态分布，采用非参数检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

3、结果

3.1 黄芪-丹参对CI/R损伤小鼠神经功能的影响

与假手术组比较，模型组小鼠神经功能损伤评分升高(P<0.05);与模型组比较，黄芪-丹参中剂量组、高剂量组及丹红注射液组小鼠神经功能损伤评分降低(P<0.05),见表1。

表1 各组小鼠神经功能损伤评分比较

3.2 黄芪-丹参对CI/R损伤小鼠脑梗死面积的影响

与假手术组比较，模型组小鼠脑梗死面积百分比增加(P<0.05);与模型组比较，黄芪-丹参高剂量组及丹红注射液组小鼠脑梗死面积百分比减少(P<0.05),见图1。

3.3 黄芪-丹参对CI/R损伤小鼠脑组织缺血区域病理形态的影响

假手术组小鼠脑组织细胞结构正常，排列整齐，未见明显病理性改变；模型组小鼠脑组织缺血区域细胞排列杂乱无序，出现空泡性改变，血管扩张，间质水肿明显；与模型组比较，黄芪-丹参中剂量组、高剂量组及丹红注射液组小鼠脑组织缺血区域的细胞损伤情况明显改善，未发现空泡性改变，血管扩张和间质水肿减轻，见图2。

3.4 黄芪-丹参对CI/R损伤小鼠脑组织缺血区域ROS水平的影响

假手术组小鼠脑组织未检测到ROS;模型组小鼠脑组织缺血区域产生大量ROS;与模型组比较，黄芪-丹参高剂量组和丹红注射液组小鼠脑组织缺血区域ROS产生明显减少，见图3。

图1 各组小鼠脑梗死面积比较(n=6)   

图2 各组小鼠脑组织缺血区域HE染色图(×400)  

图3 各组小鼠脑组织缺血区域ROS-DHE染色图(×400)   

3.5 黄芪-丹参对CI/R损伤小鼠脑组织缺血区域MPO、SOD、MDA含量的影响

与假手术组比较，模型组小鼠脑组织MPO、MDA含量升高(P<0.05)且SOD含量降低(P<0.05);与模型组比较，黄芪-丹参低剂量组、中剂量组、高剂量组及丹红注射液组小鼠脑组织MPO、MDA含量降低(P<0.05)且SOD含量升高(P<0.05),见表2。

3.6 黄芪-丹参对CI/R损伤小鼠脑组织缺血区域Nrf2、HO-1蛋白表达水平的影响

与假手术组比较，模型组小鼠脑组织Nrf2、HO-1蛋白表达水平降低(P<0.05);与模型组比较，黄芪-丹参中剂量组、高剂量组及丹红注射液组小鼠脑组织Nrf2、HO-1蛋白表达水平升高(P<0.05),见图4。

表2 各组小鼠脑组织缺血区域MPO、SOD、MDA含量比较

图4 各组小鼠脑组织缺血区域Nrf2、HO-1蛋白表达水平比较  

4、讨论

《中国急性缺血性脑卒中诊治指南》指出中药治疗脑卒中的可行性[14]。中医药强调“整体观”指导下的辨证论治，中药防治脑卒中具有多成分、多靶点、多效应的优势[15,16]。其中，黄芪、丹参两味中药的配伍主要来源于首届国医大师邓铁涛教授的临床经验方。目前临床上也有许多黄芪-丹参药对的佐证报道[4]。中药治疗脑卒中的长期用药规律也提示，黄芪和丹参的使用频率高且为重要药对[17]。

临床上神经功能损伤与CI/R密切相关[18],脑梗死的严重程度更是直接关系到患者的预后情况，大脑的保护作用也是以减小梗死面积为前提[19]。因此，本研究首先通过神经功能评分及脑梗死面积测定来验证黄芪-丹参药对对CI/R损伤的保护作用，研究发现黄芪-丹参药对能够减轻神经功能损伤，减小脑梗死面积。HE染色进一步证实黄芪-丹参药对能明显改善脑组织缺血区病理损伤。以上结果均说明黄芪-丹参药对对CI/R损伤具有显著的脑保护作用。

研究发现，黄芪及其主要活性成分黄芪甲苷、毛蕊异黄酮等能改善抗氧化酶活性，抑制细胞凋亡，减轻CI/R损伤[20,21]。丹参及其主要活性成分丹参素、丹酚酸B、丹参酮ⅡA等具有较强的抗氧化能力，可以清除体内自由基，对CI/R脑组织具有明显的保护作用[22]。因此，本研究进一步观察黄芪-丹参药对对CI/R损伤后氧化应激的影响。检测ROS最主要的方法是利用荧光探针，探针DHE与ROS反应后形成荧光产物二氢乙烯八酮(DHEO),检测DHEO的荧光强度就可以反映ROS的水平[23]。本研究发现黄芪-丹参药对能降低脑组织缺血区ROS水平。MPO、SOD及MDA是氧化应激损伤的常用指标，也是CI/R损伤发生过程中的关键分子[24]。研究发现MPO水平异常与局灶性CI/R损伤程度密切相关，MPO和MDA水平升高会加重脑组织水肿程度[25,26],而提高脑组织SOD水平能够促进脑组织损伤的恢复[27]。本研究发现给予不同剂量的黄芪-丹参后，脑组织MPO和MDA水平呈剂量依赖性降低，而SOD水平呈剂量依赖性升高。以上结果均提示黄芪-丹参药对能够增强CI/R损伤后脑组织的抗氧化应激能力，进而修复脑组织缺血区域的损伤，这与以往的研究报道一致[28,29]。

Nrf2/HO-1通路是调节组织细胞氧化应激反应的重要信号通路，Nrf2在正常组织细胞内发挥调节氧化还原功能的作用[30,31],并调控HO-1通路相关蛋白，清除自由基及细胞因子，维持细胞内氧化还原稳态[32]。CI/R后脑组织细胞Nrf2表达异常，HO-1抗氧化能力降低，进而导致氧化应激损伤的发生[33]。研究发现，通过Nrf2/HO-1信号通路改善缺血性脑卒中的临床常见中药中，丹参、黄芪出现频次较高[34]。另外，在肾脏纤维化治疗中，黄芪-丹参可调控Nrf2信号通路，发挥抗氧化应激损伤作用[35]。本研究发现模型组小鼠脑组织Nrf2、HO-1水平显著降低，提示Nrf2/HO-1通路下调与CI/R损伤的发生密切相关[36]。黄芪-丹参各剂量组小鼠脑组织Nrf2、HO-1水平升高，提示黄芪-丹参药对能够激活脑组织Nrf2/HO-1通路。

综上所述，黄芪-丹参药对能够减轻小鼠CI/R损伤，其机制可能与调节脑组织氧化应激和Nrf2/HO-1信号通路有关。

参考文献:

[2]王晓平,倪京满.脑缺血再灌注损伤的研究及药物治疗进展[J].中国新药杂志,2016,25(6):659-663,691.

[3]初孟霞,刘树权.中药保护脑缺血再灌注损伤作用的研究进展[J].中医临床研究,2023,15(24):30-35.

[4]陈雨菡,马善波,杨倩,等.黄芪-丹参药对治疗缺血性脑卒中研究进展[J].陕西中医,2021,42(8):1142-1146.

[5]邓中光,邱仕君.邓铁涛运用黄芪的经验[J].北京中医,1994,13(1):5-8.

[6]姜德远.黄芪丹参汤治疗脑梗死恢复期的临床疗效及炎性因子水平的影响[J].中国中医药现代远程教育,2018,16(5):99-100.

[7]刘金栋.黄芪､丹参合用治疗急性脑梗死的疗效观察[J].世界最新医学信息文摘,2016,16(85):164.

[8]王新东,卞勇,祁晓霞.黄芪丹参水煎液激活AMPK上调自噬抑制ISO诱导的大鼠心肌重构[J].中药材,2017,40(10):2433-2436.

[9]田露,孔旋,刘俊,等.黄芪丹参不同配伍对气虚血瘀模型大鼠血液流变学和血管内皮因子的影响[J].现代生物医学进展,2017,17(9):1643-1647.

[10]麦筱莉,韩冰,范海健,等.小鼠缺血性脑梗死模型的制作及7TMR成像的实验研究[J].医学影像学杂志,2012,22(10):1755-1758.

[11]徐淑云,卞如濂,陈修.药理实验方法学[M].北京:人民卫生出版社,2002:203.

[12]张立新,段立楠,刘晓丽,等.丹参-黄芪配伍对急性心肌缺血模型小鼠的影响及作用机制[J].河北中医,2020,42(11):1680-1684,1730.

[13]张乐国,朱翠敏,夏瑞雪,等.汉黄芩素调节Notch信号通路对脑缺血/再灌注模型小鼠神经细胞凋亡的影响[J].卒中与神经疾病,2024,31(1):8-13.

[14]钟迪,张舒婷,吴波.《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2018》解读[J].中国现代神经疾病杂志,2019,19(11):897-901.

基金资助:陕西省重点研发计划项目(2020SF-322);陕西省自然科学基金青年项目(2024JC-YBQN-0993);陕西中医药大学博士科研启动金项目(306/171020323018);

文章来源:杨文君,董盛,陈雨菡,等.黄芪-丹参对脑缺血/再灌注损伤小鼠氧化应激的影响[J].中医学报,2024,39(05):1045-1052.