慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是一种常见的、严重危害患者生活质量和生命健康的慢性肺部疾病，与气体或烟雾等有害颗粒引起的肺部炎症反应有关[1,2,3]。COPD发病机制复杂，其中炎症是贯穿整个发病过程的关键机制，抑制炎症反应是干预COPD进程的关键途径。巨噬细胞在COPD等疾病的炎症反应中发挥着重要作用[4,5,6,7],可促进多种炎症介质释放，招募炎症细胞浸润，参与COPD炎症的形成[8,9]。补肺健脾方辨证治疗COPD疗效显著，可有效降低急性加重频率及持续时间、改善症状、提高运动耐力和生活质量[10],然而其干预机制及配伍规律尚待于进一步研究。因此，本文基于脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的巨噬细胞炎症反应模型，探析补肺健脾方及其配伍干预炎症反应的机制。

1、资料与方法

1.1 细胞

THP-1人单核细胞购自上海子实生物科技有限公司。

1.2 药品与试剂

本文将补肺健脾方中药功效分为补肺(党参、炙黄芪)、健脾(白术、茯苓、黄精)、温肾(淫羊藿)、止咳化痰(厚朴、陈皮、浙贝母、紫菀)、活血通络(矮地茶、地龙)。补肺、健脾、温肾构成扶正，止咳化痰、活血通络构成祛邪两大类配伍。

浙贝母(批号：20120106)、陈皮(批号：20120102)购自郑州瑞龙制药股份有限公司；矮地茶(批号：C20090302)购自安徽润德药业有限公司；姜厚朴(批号：100913)购自安徽济人药业有限公司；炙紫菀(批号：161101)购自安徽亳州浙皖中药饮片有限公司；炙淫羊藿(批号：1711005)购自江西樟树天齐堂中药饮片有限公司，采用70%乙醇回流提取；酒黄精(批号：18080103)、党参(批号：20100102)、地龙(批号：17080105)购自郑州瑞龙制药股份有限公司；炒白术(批号：180901)购自安徽亳州市广源堂中药饮片有限公司；茯苓(批号：2101081)购自安徽普仁中药饮片有限公司；炙黄芪(批号：210101)购自安徽人民中药饮片有限公司。水煎煮上述中药，并通过大孔树脂层析柱纯化中药提取物，获得冻干粉。

RPMI 1640培养基(货号：C11875500BT)由美国Gibco公司提供，脂多糖(货号：08168)由美国Sigma公司提供，佛波酯(货号：HY1839)由美国MedChemExpress公司提供，胎牛血清(货号：S711-001S)由上海Lonsera公司提供，青霉素-链霉素溶液(货号：PB180120)、PBS缓冲液(货号：PB180327)由武汉Procell公司提供。

1.3 细胞培养及炎症模型构建

THP-1细胞置于1640完全培养基中，在体积分数5% CO2、37 ℃的培养箱中培养，每2～3天换液一次。THP-1细胞接种于35 mm培养皿中(每孔1×106个),给予佛波酯(100 μg·L-1)诱导24 h后得到M0巨噬细胞。将细胞分为对照组、模型组、中药干预组，模型组给予LPS(100 μg·L-1)干预获得巨噬细胞炎症反应模型，中药干预组给予LPS(100 μg·L-1)+相应中药提取物(100 mg·L-1)干预，24 h后收取细胞。

1.4 mRNA提取、高通量测序

采用TRIzol®Reagent提取总RNA,利用带有Oligod(T)的Beads纯化mRNA,基于北京博奥晶典生物技术有限公司的Illumina测序平台对mRNA样本进行高通量测序，获得高通量基因表达谱数据(fragments per kilobase million, FPKM)值。

1.5 基因集富集分析

从MSigDB(Human Molecular Signatures Database)官网下载到Gene Ontology数据库的7 481个生物学过程(biological process)用于后续的基因集富集分析。利用GSEA软件[10,11](4.1.0版)(permutation type=gene set, 其他参数为默认值)鉴定巨噬细胞炎症反应相关通路，并据此筛选经中药干预后失调方向发生显著回调的通路。以巨噬细胞炎症反应的富集评分(normalized enrichment score, NES)为基础，假设巨噬细胞炎症反应模型经某一中药干预后，其NES值由NES<0(NES>0)变成NES>0(NES<0),则定义该通路的失调方向发生了回调[12]。补肺健脾方各配伍干预巨噬细胞炎症反应相关通路的强度，采用其相应配伍包含的每味中药显著回调信号通路对应NES值的加和表示[12,13]。某一通路可能被配伍中的多个中药显著回调，表明该配伍对此通路具有更强的调控强度。因此，本文对该部分可能重复的通路，计算其富集评分的累加值以反映配伍对其的调控强度。

对于某一特定通路，假设某一配伍中至少有一味中药可显著回调此通路的方向，则定义该配伍可显著回调此通路。本文以每条巨噬细胞炎症反应相关通路为研究对象，逐一判断某一配伍是否可以显著回调此通路的方向，以确定此配伍显著回调通路的个数。该配伍显著回调通路的逆转率为：显著回调通路数目/炎症反应相关通路数目。假设通路A在各配伍中均被显著回调，则定义通路A为各配伍共性干预通路；如果通路A在某一配伍中发生显著回调，而在其他配伍中未被显著回调，则认为通路A为这一配伍的特异干预通路。

2、结果

2.1 补肺健脾方干预通路富集评分

在控制错误发现率(false discovery rate, FDR)<0.05的条件下，本研究通过GSEA方法鉴定到244条巨噬细胞炎症反应相关通路。然后，以上述244条通路为研究对象，分别计算补肺健脾方包含的党参、炙黄芪等12味中药及其配伍显著回调通路的NES(P<0.05),评价其回调通路的强度。补肺健脾方所含中药的NES为-1041.56,其中补肺配伍的为-71.25,健脾配伍的为-17.45,温肾配伍的为-211.42,止咳化痰配伍的为-363.94,活血通络配伍的为-377.50,见表1。

表1 补肺健脾方各配伍干预通路富集评分

2.2 补肺健脾方各配伍显著回调通路情况

补肺健脾方可显著回调214条通路(逆转率为87.70%),其中补肺配伍可显著回调43条通路(逆转率为17.62%),健脾配伍的为19条(逆转率为7.79%),温肾配伍的为133条(逆转率为54.51%),止咳化痰配伍的为142条(逆转率为58.20%),活血通络配伍的为187条(逆转率为76.64%);扶正配伍可显著回调150条通路(逆转率为61.48%),祛邪配伍可显著回调204条通路(逆转率为83.61%),见表2。

补肺健脾方中补肺配伍的2味中药(共2味)、健脾配伍的2味中药(共3味)、温肾配伍的1味中药(共1味)、止咳化痰配伍的4味中药(共4味)、活血通络配伍的1味中药(共2味)可显著回调Positive regulation of interleukin 1 production通路。补肺、健脾、温肾、止咳化痰、活血通络配伍中分别有2、1、1、4、2味中药可显著回调Transforming growth factor beta production通路。补肺、温肾、止咳化痰、活血通络配伍中分别有2、1、4、2味中药可显著回调Granulocyte migration和neutrophil migration通路，见表3。

表2 补肺健脾方各配伍显著回调通路情况

表3 补肺健脾方各配伍中可显著回调通路的中药数目

2.3 补肺健脾方各配伍共性和特异性干预通路结果

以补肺、健脾、温肾、止咳化痰、活血通络配伍为研究对象，揭示补肺健脾方共性和特异性干预通路。结果表明，Positive regulation of interleukin 1 production等7条通路在5个配伍中均被显著回调。Mitotic cell cycle arrest等3条通路在补肺配伍中特异回调。Response to acetylcholine通路在健脾配伍中特异回调。Negative regulation of viral entry into host cell等5条通路在温肾配伍中特异回调。Negative regulation of leukocyte chemotaxis等6条通路在止咳化痰配伍中特异回调。Negative regulation of extrinsic apoptotic signaling pathway via death domain receptors等34条通路在活血通络配伍中特异回调，见图1。

以扶正(包括补肺、健脾和温肾)和祛邪(包括止咳化痰和活血通络)配伍为研究对象，评价补肺健脾方共性和特异性干预通路情况。结果表明，Response to interferon beta等140条通路均被扶正、祛邪配伍显著回调。Negative regulation of viral entry into host cell等10条通路在扶正配伍中特异回调。Negative regulation of extrinsic apoptotic signaling pathway via death domain receptors等64条通路在祛邪配伍中特异回调，见图2。

图1 补肺健脾方中补肺/健脾/温肾/止咳化痰/活血通络配伍共性和特异性回调通路情况

图2 补肺健脾方中扶正/祛邪配伍共性和特异性回调通路情况   

3、讨论

中医药治疗COPD取得了较大进展，具有不良反应小、疗效显著等独特优势。本团队提出COPD主要病机为“正虚积损”,主要治法为“扶正祛积”[14]。在此基础上拟定的调补肺肾系列方药，辨证治疗COPD疗效明显[10,15,16],其中补肺健脾方(ZL.201110205234.6)可减少COPD患者的急性加重频率、改善症状、提高患者运动耐力及生活质量[10,17],还可显著改善COPD大鼠的一般情况、肺功能和肺组织病理损伤等，其在调节局部及系统性炎症反应方面具有明显优势[15,18,19,20],然而其抗炎机制尚需深入研究。

补肺健脾方由炙黄芪、党参、白术、茯苓、浙贝母、矮地茶等中药组成，根据中药功效可将其分为扶正(包括补肺、健脾和温肾)和祛邪(包括止咳化痰和活血通络)两大类五小类配伍，其中补肺配伍包括党参、炙黄芪，健脾配伍包括白术、茯苓、黄精，温肾配伍包括淫羊藿，止咳化痰配伍包括厚朴、陈皮、浙贝母、紫菀，活血通络配伍包括矮地茶、地龙。鉴于巨噬细胞炎症反应是COPD的关键病理环节以及补肺健脾方及其配伍规律研究的迫切需求。本课题以LPS诱导的巨噬细胞炎症反应模型为对象，分别给予补肺健脾方包含的12味中药干预，利用Illumina测序平台获得高通量基因表达谱数据，采用GSEA方法分析模型组及中药干预组通路的失调情况，基于富集评分阐释补肺健脾方及其配伍干预炎症反应的作用机制。GSEA基本原理为通过特定方法对检测的基因进行打分、排序(命名为list 1),然后采用统计学方法判断某一通路内的基因是否显著聚集在list 1的底端或顶端。这类方法(GSEA)无需筛选差异表达基因，规避了由于样本量少导致统计效能不足的问题，其对小样本数据分析具有独特优势[21,22]。

本研究发现，补肺健脾方及其各配伍可不同程度回调巨噬细胞炎症反应相关通路，回调强度及数量依次为活血通络、止咳化痰、温肾、补肺、健脾配伍，提示止咳化痰和活血通络配伍可能具有更好的干预效果。Positive regulation of interleukin 1 production等7条通路在补肺健脾方的5个配伍中均被显著回调，提示其在补肺健脾方干预炎症反应中起着关键作用。Positive regulation of interleukin 1 production和transforming growth factor beta production通路在补肺健脾方的至少10味中药中发生显著回调。IL-1β作为炎症介质，可趋化多种炎症细胞因子参与COPD气道炎症及肺组织损伤，与肺功能呈负相关[23,24,25]。TGF-β1可通过Smad信号通路导致上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT),造成COPD小气道破坏，促进气道重塑，参与肺部炎症联级反应[26,27,28]。因此，Positive regulation of interleukin 1 production和Transforming growth factor beta production通路对炎症反应的干预机制值得深入研究。Mitotic cell cycle arrest等通路在补肺配伍中特异回调，Response to acetylcholine通路在健脾配伍中特异回调，Negative regulation of viral entry into host cell等通路在温肾配伍中特异回调，Negative regulation of leukocyte chemotaxis等通路在止咳化痰配伍中特异回调，Negative regulation of extrinsic apoptotic signaling pathway via death domain receptors等通路在活血通络配伍中特异回调，提示补肺健脾方也可通过调控其各配伍的特异性回调通路抑制炎症反应。

综上所述，本研究基于巨噬细胞炎症反应模型及实验室自测的高通量基因表达谱数据和GSEA方法，以筛选到的炎症反应相关通路为基础，阐释了补肺健脾方及其配伍抑制炎症反应的作用机制。本研究仅以LPS诱导的巨噬细胞炎症反应模型为研究对象，补肺健脾方及其配伍改善COPD的作用机制尚需通过多细胞模型、多因素的系统研究深入阐释。

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基金资助:国家自然科学基金面上项目(81973822);国家自然科学基金青年项目(82305018);国家中医药传承与创新“百千万”人才工程—岐黄工程首席科学家项目{国中医药人教函[2021]7号};博士后创新人才支持计划项目(BX20200115);

文章来源:黄丽冬,关庆洲,赵鹏,等.基于基因集富集分析阐释补肺健脾方干预巨噬细胞炎症反应配伍机制[J].中医学报,2024,39(05):1076-1081.