菊苣子为菊科菊苣属植物腺毛菊苣Cichorium glandulosum Boiss.et Huet.的干燥成熟种子，俗称毛菊苣子（菊苣子药材），主要分布于我国新疆和国外的高加索、土耳其等地[1]。《新疆维吾尔自治区维吾尔药材标准》中记载，菊苣子用于清热解毒、消肿利尿、湿热黄疸和肝硬化腹水[2]，有文献报道腺毛菊苣种子、根以及地上部分均可入药[3]，其种子常以与其他药用部位配伍的形式出现于维吾尔医传统方剂中[4]，例如复方木尼孜其颗粒，护肝布祖热颗粒，迪娜尔糖浆等，具有保肝、消炎、改善体液异常的作用。另外市场上常出现菊苣Cichorium intybus L.的种子充当菊苣子药材使用，二者性状极为相似，极易混淆，但基原不同，导致成分存在一定差异，不能一概而论。目前针对腺毛菊苣种子和菊苣种子的对比研究较少，缺乏成分全面深入的研究，故实验收集二者不同产地样品，建立HPLC指纹图谱进行对比研究，并采用聚类分析（cluster analysis,CA）、正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA）等化学计量学方法进行差异分析，并测定其中5个共有成分绿原酸、秦皮乙素、1,4-二咖啡酰奎宁酸、异绿原酸A、1,5-二咖啡酰奎宁酸的含量，以期为菊苣子药材质量控制及药效物质基础研究提供参考。

1、仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；MS105DU型电子天平（瑞士梅特勒-托利公司）；UPC-1-10T型超纯水仪（四川优普超纯科技有限公司）；DZTW型调温电热套（北京永光明医疗仪器有限公司）；FW-80型高速万能粉碎机（北京永光明医疗仪器有限公司）；KQ-5200B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；EYELA N-1300型旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）。

1.2 材料

秦皮甲素（批号110740-201806）、4-羟基苯甲酸（批号101149-202204）、绿原酸（批号110753-202119）、秦皮乙素（批号110741-202109）、菊苣酸（批号111752-202105）、槲皮素（批号100081-201610）、异鼠李素（批号110860-201410）购自中国食品药品检定研究院；异绿原酸A（批号PS001052）、1,4-二咖啡酰奎宁酸（批号PS230627-06）、1,5-二咖啡酰奎宁酸（批号PS011115）购自成都普思生物科技股份有限公司；α-亚麻酸（批号S16HB192030）购自上海源叶生物科技有限公司；所有对照品质量分数均大于98%；甲醇、磷酸为色谱纯；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。经新疆维吾尔自治区药物研究所何江研究员鉴定S1～S19批药材为菊科植物腺毛菊苣C.glandulosum Boiss.et Huet.干燥成熟的种子，S20～S23为菊科植物菊苣C.intybus L.干燥成熟的种子，所有样品采收后放置于阴凉通风处自然晾干，使用前粉碎过40目筛后置于干燥器中备用。样品具体信息见表1。

2、方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：YMC-PACK ODS-A(250 mm×4.6mm,5μm）；流动相：0.2%磷酸溶液（A）-甲醇（B）；洗脱梯度：0～5 min,5%～15%B;5～10min,15%～20%B;10～15 min,20%～27.5%B,15～20 min,27.5%～30%B;20～30 min,30%～37%B;30～40 min,37%B;40～45 min,37%～50%B;45～50 min,50%～60%B;50～60 min,60%～65%B;60～65 min,65%～85%B;65～70 min,85%～100%B;70～80 min,100%B；体积流量1.0 m L/min；检测波长254 nm；柱温40℃；进样量5μL。

2.2 对照品溶液制备

精确称定秦皮甲素、4-羟基苯甲酸、绿原酸、秦皮乙素、菊苣酸、1,4-二咖啡酰奎宁酸、异绿原酸A、1,5-二咖啡酰奎宁酸、槲皮素、异鼠李素、α-亚麻酸11种对照品，加甲醇配制成质量浓度为0.043 3、0.040 5、0.044 5、0.047 0、0.046 7、0.041 5、0.045 0、0.045 8、0.042 5、0.043 7、0.083 3 mg/m L的混合对照品溶液。  

表1 不同批次药材样品信息 

2.3 供试品溶液的制备

精确称定23批次药材粉末2 g，精密加入60%乙醇20 m L，加热回流提取3 h，冷却至室温，过滤后减压蒸干，于5 m L量瓶，用甲醇定容至刻度，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.4 指纹图谱方法学考察

2.4.1 精密度试验

精确称定腺毛菊苣种子粉末（S1），按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项下色谱条件重复进样6次，以19号色谱峰1,5-二咖啡酰奎宁酸色谱峰为参照峰（S），计算各共有峰相对保留时间RSD值均小于0.07%，相对峰面积RSD值均小于3.63%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验

精确称定腺毛菊苣种子粉末(S1），按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h，按照“2.1”项下色谱条件进样测定，以19号色谱峰1,5-二咖啡酰奎宁酸色谱峰为参照峰（S），计算各共有峰相对保留时间RSD值均小于0.37%，相对峰面积RSD值均小于4.6%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.3 重复性试验

精确称定腺毛菊苣种子粉末（S1），按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.1”项下色谱条件进样测定，以19号色谱峰1,5-二咖啡酰奎宁酸色谱峰为参照峰（S），计算各共有峰相对保留时间RSD值均小于0.38%，相对峰面积RSD值均小于4.38%，表明该方法重复性良好。

2.5 指纹图谱的建立和相似度分析

2.5.1 指纹图谱的建立

取23批次药材样品粉末按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定分析，将结果色谱图数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》，以S1号样品色谱图为参照图谱，设置时间窗宽度为0.1，采用中位数法生成叠加指纹图谱进行多点校正，生成叠加图谱及对照图谱。结果表明19批腺毛菊苣种子样品HPLC图谱指认出25个共有峰，其中峰10～13、16～19、21～23经过对照品指认分别为秦皮甲素、4-羟基苯甲酸、绿原酸、秦皮乙素、菊苣酸、1,4-二咖啡酰奎宁酸、异绿原酸A、1,5-二咖啡酰奎宁酸、槲皮素、异鼠李素、α-亚麻酸。19批腺毛菊苣种子样品叠加指纹图谱和对照图谱见图1。混合对照品图谱见图2。另将4批菊苣种子样品HPLC图谱与上述19批腺毛菊苣种子HPLC图谱进行叠加，得到23批样品HPLC叠加指纹图谱，见图3，识别出19个共有峰，相较于19批腺毛菊苣种子样品HPLC指纹图谱的25个共有峰，缺少了11(4-羟基苯甲酸）、15、20、22（异鼠李素）、23(α-亚麻酸）、24号峰。根据指纹图谱色谱峰数量和面积可以初步判断腺毛菊苣种子和菊苣种子的成分种类以及含量均具有差异。

2.5.2 相似度分析

以生成的对照指纹图谱为标准，计算23批样品的相似度，结果如表2所示，样品相似度为在0.915～0.998，其中4批菊苣种子样品（S20～S23）相似度评分明显低于腺毛菊苣子样品（S1～S19），说明指纹图谱可以初步对腺毛菊苣种子和菊苣种子进行区分，并用于对菊苣子质量进行综合评价。

图1 腺毛菊苣种子样品的叠加指纹图谱和对照指纹图谱(R)

图2 混合对照品HPLC图谱  

图3 腺毛菊苣种子和菊苣种子样品的叠加指纹图谱及对照指纹图谱(R)   

2.6 化学成分含量测定

实验通过对照品比对，指认出19批腺毛菊苣种子和4批菊苣种子样品中8个共有峰，分别为秦皮甲素（峰10）、绿原酸（峰12）、秦皮乙素（峰13）、菊苣酸（峰16）、1,4-二咖啡酰奎宁酸（峰17）、异绿原酸A（峰18）、1,5-二咖啡酰奎宁酸（峰19），槲皮素（峰21），选取其中峰型较好，峰面积较大的绿原酸（峰12）、秦皮乙素（峰13）、1,4-二咖啡酰奎宁酸（峰17）、异绿原酸A（峰18）、1,5-二咖啡酰奎宁酸（峰19)5个成分建立含量测定方法，测定23批样品中的含量。

2.6.1 线性关系考察

精确称取绿原酸、秦皮乙素、1,4-二咖啡酰奎宁酸、异绿原酸A、1,5-二咖啡酰奎宁酸标准品适量，用甲醇配置成质量浓度分别为0.534、0.141、0.124 5、0.135、1.71 mg/m L的绿原酸、秦皮乙素、1,4-二咖啡酰奎宁酸、异绿原酸A、1,5-二咖啡酰奎宁酸的混合对照品溶液贮备液，取适量上述混合对照品溶液贮备液，用甲醇稀释成系列浓度的混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，以质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），计算线性回归方程，结果见表3。 

表2 23批样品指纹图谱相似度分析结果

2.6.2 精密度试验

精确称定腺毛菊苣种子粉末（S1），按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录各成分峰面积，计算峰面积RSD值小于1.36%，表明该仪器精密度良好。

2.6.3 稳定性试验

表3 5个化学成分的线性关系考察结果  

精确称定腺毛菊苣种子粉末(S1），按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h，在“2.1”项下色谱条件进样测定，记录各成分峰面积，计算峰面积RSD值，RSD值均小于3.57%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.6.4 重复性试验

精确称定腺毛菊苣种子样品粉末（S1)6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录各成分峰面积，计算质量分数，RSD值均小于2.16%，表明该方法重复性良好。

2.6.5 加样回收率试验

精确称定1 g腺毛菊苣种子样品粉末（S1)6份，分别加入一定量对照品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱峰面积，计算回收率和RSD值，绿原酸、秦皮乙素、1,4-二咖啡酰奎宁酸、异绿原酸A、1,5-二咖啡酰奎宁酸的平均回收率分别为101.03%、105.48%、111.35%、103.00%、103.25%,RSD值均小于5%。

2.6.6 样品含量测定

取23批次药材样品粉末，按照2.3项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项下色谱条件进样测定，将测得5个成分的峰面积，根据线性回归方程计算各样品中5个成分的质量分数，结果见表4。  

表4 腺毛菊苣种子和菊苣种子样品中5个化学成分含量测定结果 

2.7 化学模式识别

2.7.1 聚类分析

将23批腺毛菊苣种子和菊苣种子样品共有峰的峰面积数据导入SPSS 20.0软件，采用组间联接、平方欧式距离法进行系统聚类分析，结果见图4。当欧氏距离为25时，23批次药材样品可分为2大类，其中S5、S14、S20～23归为第1类，其余产地归为第2类。当欧氏距离为7时，第一类又可分为2小类，其中S1、S7、S10、S12、S17、S18为一类，其余样品为另一类。当欧氏距离为5时，第2类也可分为2小类，S5、S14、S20为一类，S21～S23归为一类。

图4 腺毛菊苣种子和菊苣种子系统聚类分析图   

2.7.2 主成分分析

将23批腺毛菊苣种子和菊苣种子样品共有峰的峰面积数据导入SPSS 20.0软件，进行主成分分析，以主成分特征值>1为提取标准并生成因子得分系数矩阵[5]。结果Bartlett球形检定显著性P<0.001，说明拒绝变量相互独立的假设，主成分分析成立，共得到5个主成分，方差贡献率分别为31.442%、23.883%、13.265%、9.062%、7.103%，累积方差贡献率为84.755%，说明这5个主成分可解释原有变量84.755%的信息，表明5个主成分可以代替原指纹图谱19个共有峰评价原样品，特征值及贡献率见表5。

因子载荷矩阵反映了各主成分与19个共有峰即原始变量之间的相关系数，结果见表6，主成分因子1特征值为5.974，主要反映了共有色谱峰1、2、3、8、13、14、21、25的信息，主成分因子2特征值为4.538，主要反映了色谱峰4、5、6、14、17的信息，主成分因子3特征值为2.520，主要反映了色谱峰12、16、18的信息。主成分因子4特征值为1.722，主要反映了色谱峰7的信息，主成分因子5特征值为1.349，主要反映了色谱峰9、10的信息。

表5 特征值及方差贡献率 

利用SPSS 20.0软件计算23批腺毛菊苣种子和菊苣种子样品主成分得分，并以各主成分对应的贡献率为权重系数计算综合得分，结果见表7。其中S19、S16、S15、S13腺毛菊苣种子样品排名靠前，说明这4批腺毛菊苣种子质量较好，而4批菊苣种子S20、S23、S21、S22排名均靠后，说明相较于腺毛菊苣种子这4批菊苣种子质量相对较差，进一步体现了腺毛菊苣种子与菊苣种子之间的差异。

2.7.3 OPLS-DA分析

为了更直观地体现组间差异，进行OPLS-DA建模分析，筛选出对组间差异贡献率较大的成分。以23批次腺毛菊苣种子和菊苣种子样品指纹图谱中19个共有峰峰面积为变量导入SIMCA-P 14.1软件，进行OPLS-DA建模分析，建立模型。OPLS-DA得分结果（图5),RX2(cum)=0.833,RY2(cum)=0.789,Q2(cum)=0.708，说明模型具有较好的解释预测能力，通过200次置换验证（图6),R2和Q2的回归线斜率均大于0,R2和Q2的回归线截距为0.195和-0.518，表明置换验证结果较为理想，不存在过拟合现象出现，OPLS-DA得分图结果表明23批药材样品被分为3类，成都和巴基斯坦腺毛菊苣种子（S15、S16、S19）为一类，所有新疆和辽宁腺毛菊苣种子为一类，所有菊苣种子（S20～S23）为一类，可以说明不同地区腺毛菊苣种子之间以及腺毛菊苣种子和菊苣种子之间均存在差异。变量重要性投影（variable importance in projection,VIP）值是筛选差异性化合物的重要指标，成分VIP值越大，表明该成分对组间差异的影响越大[6]。通过对VIP值进行分析，得到差异性标记物的VIP得分图（图7）。以VIP值>1为阈值，推测峰19(1,5-二咖啡酰奎宁酸），峰21（槲皮素）、峰12（绿原酸）、峰16（菊苣酸）可能为对组间差异影响较大的成分，是菊苣子质量控制的关键成分。

表6 因子载荷矩阵  

表7 腺毛菊苣种子和菊苣种子样品主成分得分和综合得分

图5 腺毛菊苣种子和菊苣种子样品OPLS-DA得分平面图  

图6 腺毛菊苣种子和菊苣种子样品置换验证图   

图7 腺毛菊苣种子和菊苣种子样品共有色谱峰VIP得分图  

3、讨论

实验分别考察了不同提取溶剂（超纯水，50%、60%、70%、80%、90%、100%甲醇，50%、60%、70%、80%、90%、95%乙醇），提取方法（超声提取法、加热回流提取法），提取时间（1、2、3、5、7h），提取次数（1、2、3次）。色谱条件考察了不同流动相（甲醇-0.1%磷酸、甲醇-0.2%磷酸、甲醇-0.4%磷酸、乙腈-0.2%磷酸、甲醇-0.2%甲酸、甲醇-0.2%乙酸），柱温（25、30、40℃），进样量（5、10μL），此外还对供试品溶液进行200～400 nm全波长扫描，发现样品经60%乙醇加热回流单次提取3 h，在流动相为甲醇-0.2%磷酸、柱温40℃、进样量5μL、检测波长254 nm的液相条件下，指纹图谱色谱峰分离度、峰型、峰数量、塔板数均较高，指纹图谱的整体效果最佳，可满足指纹图谱的建立要求。

实验对23批次腺毛菊苣种子、菊苣种子叠加指纹图谱进行比较，结果显示腺毛菊苣种子和菊苣种子的图谱色谱峰数量和色谱峰面积均存在差异。19批腺毛菊苣种子叠加指纹图谱比23批腺毛菊苣种子和菊苣种子的指纹叠加图谱多识别出了6个共有峰，多指认出了4-羟基苯甲酸、异鼠李素、α-亚麻酸3个共有成分，表明腺毛菊苣种子所含成分种类更加丰富，其中4-羟基苯甲酸具有抗菌、抗炎的功效[7,8],α-亚麻酸可以降血糖、调血脂并且能有效改善非酒精性脂肪肝病[9,10]，验证了腺毛菊苣种子作为菊苣子药材使用具有更好的抗菌、抗炎、调血脂、保肝活性的科学性。

为了更加客观全面地评价了腺毛菊苣种子和菊苣种子的质量，利用化学模式识别法对23批腺毛菊苣种子和菊苣种子化学组分进行分析[11]，在对指纹图谱的相似度分析中，样品相似度均大于0.9，但4批菊苣种子相似度明显低于其他批次腺毛菊苣种子，体现了腺毛菊苣种子和菊苣种子样品之间化学成分含量的差异。聚类分析中在欧式距离为10时，样品被分为2类，推测S5和S14 2批样品因质量较差与S20～S23菊苣种子同为一类。根据PCA分析综合得分结果，推测产于巴基斯坦和成都的3批腺毛菊苣种子样品整体质量较高，腺毛菊苣种子与毛菊苣种子样品之间整体质量存在一定差距，与指纹图谱研究结果相对一致。OPLS-DA分析结果结合腺毛菊苣种子样品产地地理位置，由于新疆和辽宁纬度相近，成都和巴基斯坦纬度相近，推测造成腺毛菊苣种子种内差异的主要因素可能与纬度有关，腺毛菊苣种子和菊苣种子则因为药材基原的不同存在种间差异，表明OPLS-DA分析结果与聚类分析和PCA分析结果趋于一致且进行相应补充。VIP值分析筛选出1,5-二咖啡酰奎宁酸（峰19），槲皮素（峰21）、绿原酸（峰12）等重要成分，其中咖啡酰奎宁酸类化合物具有抗氧化、抗炎、抗微生物和保肝作用[12],1,5-二咖啡酰奎宁酸在保肝、抗肝损伤、治疗肝纤维化和乙型肝炎方面具有突出的效果，绿原酸也被证实具有降尿酸的功效[13]。槲皮素具有抗氧化、抗癌、抗炎等多种生物学活性的黄酮类化合物，通常是植物药材发挥疗效的关键成分[14]，这些成分生理活性均与菊苣子药材药理活性吻合，具有成为质量标志物的潜力。

综上，本实验建立了一种快速、稳定的腺毛菊苣种子和混伪品菊苣种子品质评价及含量测定方法，根据19批腺毛菊苣种子HPLC指纹图谱，确定了25个共有峰，通过对照品比对确认了11个共有峰所代表成分。又根据19批腺毛菊苣种子和4批菊苣种子HPLC指纹图谱确定了19个共有峰，确认了8个共有峰所代表成分，并测定了其中峰型较好，峰面积较大的5个成分的含量。结合化学模式识别法确定了腺毛菊苣种子和混伪品菊苣种子之间的质量差异，筛选出4个差异指标物：1,5-二咖啡酰奎宁酸、槲皮素、绿原酸和菊苣酸，为菊苣子资源开发和利用提供了有力依据，为菊苣子的质量评价提供了参考，后续还可将菊苣子HPLC指纹图谱与其药效活性研究相结合，通过建立谱-效关系，明确质量标志物，确定反映菊苣子内在质量的评价方法。

参考文献:

[1]中国科学院中国植物志编辑委员会.马其云等编著.中国植物志-拉丁名索引:1959—1992[M].北京:科学出版社, 1997.

[2]国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草.分卷[M].上海:上海科学技术出版社, 2005:326-328.

[3]新疆维吾尔自治区食品药品监督管理局.新疆维吾尔自治区维吾尔药材标准[M].乌鲁木齐:新疆人们卫生出版社, 2010:56.

[4]李茜,杨建华,臧薇,等.毛菊苣根-毛菊苣子配伍的化学成分研究[J].中国现代应用药学, 2022, 39(5):584-588.

[5]周冰倩,高喜梅,杨颖,等.不同来源竹茹药材HPLC指纹图谱和化学计量学分析[J].中草药, 2022, 53(3):853-857.

[6]王娜,程璐,王浩,等.茯神指纹图谱结合化学模式识别和多指标成分定量研究[J].中草药, 2024, 55(1):279-286.

[7]黄宇飞,张楠,周忠玉,等.毡毛马兰酚性成分及其抗肿瘤活性[J].中成药, 2020, 42(11):2922-2926.

[8]陈淋敏.一点红化学成分分离､分析及抗氧化活性研究[D].南宁:广西大学, 2014.

[9]常松林,高晓余,柳双凤,等. α-亚麻酸对高脂饮食和链脲佐菌素诱导Ⅱ型糖尿病模型小鼠的降血糖作用[J].中国食品学报, 2021, 21(10):86-94.

[10]李晓钰,郑明明,郭艳,等. α-亚麻酸植物甾醇酯抑制氧化应激改善非酒精性脂肪性肝病[J].营养学报,2020, 42(6):575-580.

[11]李洋,陈健,张越,等.基于指纹图谱结合化学模式识别及多成分含量测定的白芍药材质量评价研究[J].中草药, 2022, 53(1):231-237.

[12]赵昱,赵军,李湘萍,等.咖啡酰奎尼酸类化合物研究进展[J].中国中药杂志, 2006, 31(11):869-874.

基金资助:“天山英才”-青年拔尖人才项目(2022TSYCCX0022); 新疆维吾尔自治区重点研发项目(2022B03007-2);

文章来源:陈旭,姜建双,李德华,等.HPLC指纹图谱和多成分定量结合化学模式识别评价菊苣子质量[J].中草药,2024,55(13):4526-4534.