高脂血症是一种代谢性疾病,其特征是血液中脂质水平升高,临床表现为甘油三酯(TG)､胆固醇､低密度蛋白升高脂(LDLGC),高密度脂蛋白降低(HDLGC).高脂血症是动脉粥样硬化的主要危险因素之一,该疾病表现为血管内脂质斑块的形成,最终导致血管狭窄和阻塞[1].这不仅增加了心脏病和中风的风险,还可能导致其他心血管疾病[2].此外,高脂血症还与代谢性疾病如糖尿病､肥胖等密切相关[3].合理的饮食､适度的运动､戒烟和限制酒精摄入是管理高脂血症的重要方式[4];而对于一些尤其是在改变生活方式后仍患有高脂血症的人,可以使用降脂药物,如他汀类药物､胰岛素抵抗调节剂等,以维持体内正常血脂水平.

人参皂苷Rb1是一种甾体皂苷化合物,是人参的主要活性成分,具有良好的营养和药用价值[5].已有研究报道其具有多种生物学功能,包括降脂､抗高血糖､减轻胰岛素抵抗和调节代谢功效等[6-8].课题组在前期研究中也发现,Rb1具有较好的体内糖脂代谢调节能力,Rb1干预后显著 降 低 大 鼠 血 清 的 LDLGC､TG 和 TC 的 水 平,对HDLGC水平无影响.与 HFD组相比,Rb1干预后糖化血清蛋白(GHb)显 著 降 低,同 时 血 糖 有 显 著 下 降 趋 势;此外,在油红 O 染色与 H&E 染色试验中,Rb1 治疗组使大鼠肝组织中的脂滴聚集显著减少,同时附睾脂肪细胞显著变小,表明其在开发预防治疗高脂血症的保健食品/药品方面具有良好的潜力[9].然而,由于人参皂苷在胃酸环境中容易被分解,且肠道黏膜透过性较低,导致口服后其生物利用度受限,制约了其口服制剂的临床应用.为了提高人参皂苷 Rb1生物利用度,有研究人员尝试采用纳米递送系统解决该问题,如 Liu等[5,10]通过提高 Rb1在纳米胶囊中的包封率约为99.79%,从而提高 Rb1的口服利用度.这些研究为克服人参皂苷 Rb1在实践应用中的限制提供了有益的解决方案.

植物甾醇是一种天然的降脂活性物质,其中βG谷甾醇作为植物甾醇中最为重要的成分之一,具备多种生理活性,能够降低体内胆固醇水平,通过抑制胆固醇吸收促使体内血脂含量降低[11].由于βG谷甾醇分子结构与胆固醇相 似,可 以 替 代 构 建 脂 质 体 的 主 要 成 分———胆 固 醇.一方面可以增强磷脂双层的物理和化学性质,同时降低胆固醇可能引发的与补体激活相关的过敏反应和心血管副作用,如肺动脉高压等[12-13];另一方面,可以发挥βG谷甾醇的降脂功能,通过与 Rb1联用达到协同增强降脂能力的效果,改善 Rb1的生物利用度.尽管目前已有研究[5,10]表明通过纳米载体 系 统 可 以 有 效 改 善 或 提 高 人 参 皂 苷Rb1的生物利用度,但关于人参皂苷与植物甾醇联合用于纳米递送系统的构建以提高人参皂苷 Rb1 的降脂效果及其生物利用度的相关研究还鲜有报道.

研究基于脂质体的两亲性､无毒性和生物相容性等特点,结合βG谷甾醇与人参皂苷 Rb1 的降脂特性,制备出βG谷甾醇修饰的 Rb1 脂质体.并通过结构表征与细胞生物学评价等手段对脂质体的结构与降脂活性进行分析,为人参皂苷 Rb1降血脂产品的开发应用提供支持.

1、材料与方法

1.1 材料与试剂

人参皂苷Rb1:纯 度 98%,上 海 源 叶 生 物 科 技 有 限公司;

谷甾醇:纯度70%,上海金穗生物科技有限公司;

LGαG磷脂酰胆碱:纯度95%,南通飞宇生物科技有限公司;

油红O 干粉:纯度≥75%,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;

小牛血清:美国SigmaGAldrich公司;

DMEM 高糖培 养 基 和 丙 酮 酸 钠 100 mmol/L､非 必需氨基 酸 NEAA 溶 液 (MEM 无 酚 红)､青 霉 素—链 霉素—谷氨酰胺(100×)溶液和丙酮酸钠100mmol/L:赛默飞世尔科技(中国)有限公司;

多聚甲醛:纯度4%,上海麦克林生化科技股份有限公司;

无血清细胞冻存液:北京索莱宝生物有限公司;

台盼蓝染色液:0.4%,北京索莱宝生物有限公司;

DMEM(含 NaHCO31.5g/L)培养基:赛百慷(上海)生物技术股份有限公司;

3G异丁基G1G甲基黄嘌呤(IBMX):纯度99%,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;

胰岛素:纯度27USP/mg,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;

二甲基亚砜:纯 度 ≥99.9%,北 京 索 莱 宝 生 物 有 限公司.

1.2主要仪器

电子天平:AB104GN 型,梅特勒托利多科技(中国)有限公司;

二氧化碳培养箱:BB150G2TCSGL 型,赛默飞世尔科技(中国)有限公司;超高效液相色谱:ACQUITY Arc型,沃特世科技有限公司;

倒置荧光显微镜:IX73型,奥林巴斯光学工业股份有限公司;

超声波细胞粉碎机:JY92GIIDN 型,宁波新芝生物科技股份有限公司;

旋转蒸发仪:NG1300型,上海爱郎仪器有限公司;

Countess3全自动细胞计数仪:AMQAF2000型,赛默飞世尔科技(中国)有限公司;

高速离心机:5425R型,艾本德(上海)国际贸易有限公司.

1.3 试验方法

1.3.1 脂质体的制备

采用薄膜水和法制备脂质体,将βG谷甾醇､LGα 磷脂酰胆碱按照10∶50(毫克数)的质量比添加,使用二氯甲烷分别充分溶解后,加入圆底烧瓶中.在48 ℃下,通过旋转蒸发仪真空蒸发除去圆底烧瓶中的二氯甲烷,待在瓶底形成 一 层 脂 质 薄 膜.真 空 干 燥 2h2基础研究 FUNDAMENTALRESEARCH 总第273期 |2024年7月 |后,二氯甲烷被充分去除,将5mL溶解有10mg人参皂苷 Rb1的pH7.4的磷酸缓冲液加入圆底烧瓶,在50℃下于旋转蒸发仪旋转使瓶壁上的薄膜水化1h,均匀分布在缓冲溶液中.将制得的混悬液在室温下使用超声细胞粉碎机超声10min,其中仪器功率为270W,3s超声,5s休息,防止功率过大液体发热,损坏仪器影响破碎效率.最后,将制备好的脂质体溶液置于4 ℃冰箱保存[14].1.3.2 脂质体的形态观察 使用2%磷钨酸水溶液负染法制备待测样品.取10μL 纳米脂质体溶液,小心将样品滴于300目纯碳膜铜网格上10min,使用滤纸将过量的溶液擦除,将铜网放到2%的磷钨酸水溶液上1min,水洗后吸干表面多余水分.然后在80kV 加速电压下,用HitachiHT7700型透射电镜对其进行观察并拍照[15].1.3.3 脂质体粒径､多分散系数(PDI)､Zeta电位测定

通过使用ZetasizerNanoZS(Malverninstruments,UK)的动 态 光 散 射(DLS)技 术 分 析 脂 质 体 悬 浮 液 的 粒度､多分散指数(PDI),分析脂质体的制备是否成功.在测定之前,用去离子水将样品稀释10倍以避免多重散射效应,然后将稀释样品转移到聚苯乙烯试管中,所有测量均在25 ℃下进行,介质折射率为1.333,之后记录 Size和PDI,所有样品设置3个平行[16].取不同人参皂苷 Rb1脂质体溶液使用去离子水稀释10倍,取1mL置于 Zeta电位样品池中,用马尔文 NanoGZS90 型电位仪分析仪测定所制备脂质体的Zeta电位.

1.3.4 包封率测定

采用间接法测定包封率(entrapmentefficiency,EE).取400μL脂质体溶液加到超滤管中,于高速离心机离心制备完成的脂质体,转速为5741r/min,离心时间为 30 min.离 心 完 成 后,收 集 下 清 液,并 使 用0.22μm滤膜过滤后,采用高效液相色谱法(HPLC),测定下清液中游离的人参皂苷 Rb1 含量,记为 Wf;取100μLRb1脂质体溶液,加入900μL甲醇破乳,涡旋振荡5min,12000r/min离心5min,使用0.22μm 滤膜过滤后,采用高效液相色谱法测定总人参皂苷 Rb1含量,记为Wz;通过破乳计算的总药物量减去游离的(未包封的)药物含量,按式(1)计算脂质体的包封率.所有测定均包含3个平行样品.

1.3.5 脂质体的体外模拟药物释放

将1 mLRb1 脂质体溶液置于能截留相对分子质量>8000的溶质的透析袋中,将透析袋置于30mLPBS(pH7.4)磷酸缓冲液中,37 ℃恒温水浴搅拌,分 别 于 0.5,1.0,2.0,3.0,5.0,6.0,8.0,10.0,12.0h处,取1mL透析外介质,并使用0.22μm滤膜过滤,通过 HPLC检测不同时间段从脂质体中释放出来的 Rb1含量,每次取样后再补加相同体积新鲜磷酸缓冲液到透析外液,保证介质体积不变,HPLC 检测峰面积代入绘制的标准曲线计算 Rb1浓度,得到药物在不同时间点的累计释放量,绘制药物随时间的释放曲线.

1.3.6 傅里叶红外光谱

将制备好的含有冻干剂的样品于-80 ℃冰箱预冻后置于真空冷冻干燥机干燥后,称取适量无水溴化钾晶体于玛瑙研钵中研磨,直至晶体呈现细腻的粉末状.分别舀取冻干产物和溴化钾放置于玛瑙研钵中混匀研磨直至无颗粒状[15].手动压片,将成片放入红外光 谱 工 作 站 内,具 体 参 数 设 置:光 谱 范 围 400~4000cm-1,分辨率4cm-1,扫描64次,即可开始测试并记录.根据扫描范围和透射率进行作图,对比研究脂质体包裹前后的特征官能团之间差异.分析之前记录背景光谱.

1.3.7 3T3GL1前脂肪细胞的诱导

将前脂肪细胞3T3GL1于细胞培养瓶培养至细胞密度为70%~80%,将细胞接种于6孔板,每孔接种量1×105,使用生长液使细胞长到100%融合时并再生长48h(记为第0天),将细胞培养在含有0.5 mmol/LIBMX,1DEX和2μmol/L罗格列酮的μ诱g/导m液L培胰养岛基素中,1培μ养mol/L2d,可以看到细胞由融合态的圆形变得更加纤细.后将培养基更换为1μg/mL胰岛素脂肪细胞维持培养基3d,由于细胞中开始产生游离的脂肪酸,培养液开始逐渐变黏稠,3d之后再使用分化液培养基继续培养8d(每2d换培养基一次),之后,脂肪细胞被诱导成功,此时细胞表现出脂肪细胞表型.

1.3.8 细 胞 毒 性 试 验

3T3GL1 前 脂 肪 细 胞 按5000个/孔种在96孔板上,将细胞与不同浓度 Rb1 脂质体(10,50,100,200μmol/L)共同孵育,并以空白组作对照为与细胞一起孵育,培养24h后进行细胞毒性测试.使用酶标仪测量490nm 处的吸光度,并将结果转化为细胞存活率百分比,评估细胞活力.

1.3.9 脂肪细胞中

TG 的含量 油红 O 染色原理:油红O 为脂溶性染料,在脂肪内能高度溶解,可特异性地使组织内甘油三酯等中性脂肪着色.前脂肪细胞在诱导分化剂的作用下分化为成熟脂肪细胞后,采用油红 O 染色可使分化的细胞内脂质特异性着色,而未分化的细胞和细胞内非脂质聚集的部分不能着色,甘油明胶封片可长期保存.用负载 Rb1 的纳米脂质体处理分化的 3T3GL1细胞24h,用磷酸盐缓冲液 PBS轻柔洗涤细胞3次.4%多聚甲醛在室温下固定1h(10%甲醛30 min).再次洗涤使用 PBS和60%异丙醇分别洗涤细胞多次并干燥.使用质量浓度为0.5g/100 mL 的油红 O 工作液染色1h.蒸馏水漂洗去除未染色的染料并干燥,在倒置显微镜下观察染 色 的 脂 滴 并 拍 照.100% 的 异 丙 醇 溶 解 脂 滴3|Vol.40,No.7 尤晓颜等:人参皂苷 Rb1脂质体的制备及对脂肪细胞中脂滴积聚的抑制作用15min(可使用摇床震荡),使用酶标仪在510nm 处测量其吸光度测量 TG含量.

1.4 数据处理数据和图表使用

GraphPadPrism8.0软件生成,数据表示为 Mean±SD.平均值采用非配对t检验进行比较,显著性水平设定为0.05(P<0.05),所有测量值重复3次.

2、结果与讨论

2.1 脂质体形态及其理化性质

采用透射电镜对荷载Rb1 的脂质体βGRb1GLip和未荷载 Rb1的空载脂质体βGLip的形态进行观察.如图 1所示,两种脂质体均呈现球状结构,βGLip外形圆润光滑,βGRb1GLip外层凹凸,内层存在明显的包裹结构,这与人参皂苷 Rb1包裹在脂质体的亲水性内核中有关.与βGLip相比,βGRb1GLip的粒径及 Zeta电位无明显变化,这与两者的粒径分布结果相一致.由表1可知,βGRb1GLip的粒径､多 分 散 指 数､Zeta电 位 和 包 封 率 分 别 为 (197.37±0.98)nm､0.16±0.02､(-0.83±0.05)mV 和 83.73%.杨艳芳等[17]研究发现,纳米粒子的膜透过性与其粒径有关,随粒径增加透膜效率降低,粒径500nm 以上的粒子很难 跨 越 极 性 上 皮 细 胞 进 入 循 环 系 统,粒 径 为 20~200nm 的脂质体是局部药物通过细胞间渗透途径进入活表皮的最佳状态.βGRb1GLip的粒径低于200nm,表明其具有良好的透膜效果.

2.2 βGRb1GLip的体外释放效果

以游离人参皂苷Rb1 (FRb1 )为 对 照,对 脂 质 体βGRb1GLip的体外释 放 效 果 进 行 了 测 定,结 果 如 图 2 所示.游离人参皂苷 Rb1在前3h内即从 透 析 袋 内 向 外 部

图1 βGLip和βGRb1GLip的形态观察

表1 βGLip和βGRb1GLip的理化性质特征T

图2 游离人参皂苷 Rb1和βGRb1GLip的体外药物释放曲线

快速释放完毕(释放率100%),表明透析袋对药物释放没有保留效应[10].与之相比较,脂质体βGRb1GLip荷载的人参皂苷 Rb1则具有明显的缓释效果,在前2h内βGRb1GLip组显示 Rb1快速释放,可能是样品中部分游离的 Rb1及附着在脂质体表面未包封的 Rb1 在模拟体外释放过程中从透析 袋 中 突 释[18].随 后,Rb1 释 放 率 缓 慢 增 加,在12h时βGRb1GLip中 Rb1释放率约为80%,表现出明显的缓释效果,可能是由于脂质体的双分子层对βGRb1GLip中的 Rb1起到了屏障保护作用,可以促进药物的长期吸收,从而提高其生物利用度[19].2.3 傅里叶红外光谱分析采用 FTIR 对脂质体βGRb1GLip在不同波长下的红外辐射吸收特性进行分析,对其结构进行表征.Rb1单体和脂质体βGRb1GLip的 FITR光谱图如图3所示.Rb1单体的红 外 光 谱 在 3366cm-1 处 有 一 个 宽 吸 收 峰,这 是—OH基团拉伸振动 特 征 峰,在 2944cm-1 处 的 峰 对 应—CH2基团的拉伸振动,C═ O 和 C—O—C键分别位于1647.7cm-1处和1038,1074,1162cm-1处.—CH 的弯曲振动 出 现 在 1387.9,626cm-1 6 个 环 中.相 对 于Rb1单体,脂质体βGRb1GLip在2944cm-1处吸收峰增强,1647.7cm-1处吸收峰发生偏移,可能是由于磷脂分子与βG谷甾醇和Rb1单体通过氢键发生相互作用;此外,与空

图3 Rb1､βGLip及βGRb1GLip的傅里叶红外光谱图

基础研究FUNDAMENTALRESEARCH 总第273期 |2024年7月 |白的βGLip 相 比 在 1602cm-1 处 出 现 吸 收 峰 增 强,在1365cm-1处—CH 弯曲振动增强,可能是因为 Rb1 包裹在脂质 体 中 使 得 脂 质 体 的 红 外 辐 射 吸 收 特 性 发 生 了变化[20].2.4 细胞毒性试验在3T3GL1细胞增殖分化过程中,使用不同剂量(10,50,100,200μmol/L)的βGRb1GLip脂质体处理3T3GL1细胞24h 后,通 过 MTT 检 测 试 剂 盒 检 测 不 同 浓 度 的βGRb1GLip脂质体对3T3GL1脂肪细胞活力是否有影响.如图4所示,不同浓度βGRb1GLip脂质体对3T3GL1脂肪细胞生长增殖无明显毒副作用,且各组之间差异不显著,表明脂质体βGRb1GLip在所选取的浓度范围内生物兼容性较好,可以用于后续研究.

图4 βGRb1GLip的 MTT检测

前脂肪细胞的诱导及脂质体干预后脂滴积聚情况采用IPS诱导的方式,对3T3GL1前脂肪细胞进行诱导,如图5所示,脂肪细胞在诱导之前呈梭形,未见明显脂滴;培养诱导10d后,细胞由梭形变圆,出现小圆形脂图5 3T3GL1脂肪细胞的诱导Figure5 Inductionof3T3GL1adipocytes滴;继续诱导2d,细胞变得更大,多为圆形或椭圆形,胞浆内脂滴随之变多;诱导第14天,80%以上的细胞内出现大量脂滴.与此同时,在对照组细胞中出现明显的“环状”脂滴,证明3T3GL1前脂肪细胞在第14天被成功诱导成为成熟的脂肪细胞.

从图6可以看出,与空白对照组相比较,200μmol/L 游离的单体 Rb1 组(对照组)中脂滴堆积面积减少,通过酶标仪测量 TG 含量,发现二者差异显著.

由图7 可 知,与 对 照 组 相 比,相 同 浓 度 的 Rb1 脂质体 组 中 脂 滴 堆 积 面 积 减 少 ,表 明 同 浓 度 的 脂 质 体 对∗P<0.05;∗∗P<0.01;∗∗∗P<0.001

图6 3T3GL1脂肪细胞的 TG含量测定

图7 3T3GL1脂肪细胞油红 O 染色结果

尤晓颜等:人参皂苷 Rb1脂质体的制备及对脂肪细胞中脂滴积聚的抑制作用3T3GL1脂肪细胞中脂滴生成的抑制率大于相同浓度游离的人参皂苷 Rb1.此外,50μmol/L脂质体的脂滴抑制率大于200μmol/L 游 离 Rb1 的,结 果 具 有 显 著 性(P<0.05).与体 外 释 放 结 果 相 吻 合,脂 质 体 βGRb1GLip 对3T3GL1脂肪细胞脂滴的抑制作用优于相同浓度的游离单体 Rb1.3 结论采用薄膜水和法制备了谷甾醇修饰的人参皂苷 Rb1脂质体,通过对脂质体进行结构与性质表征发现加入人参皂苷 Rb1后脂质体结构发生明显变化,脂质体表面粗糙,形状由圆润变得不规则;此外,脂质体具有较小的粒径和较高的包封率,有较好的缓释特性.试验结果表明,随着人参皂苷 Rb1浓度增加,谷甾醇修饰的人参皂苷 Rb1脂质体对3T3GL1无明显细胞毒性,可以用于后续试验的探究.与游离人参皂苷 Rb1相比,相同浓度人参皂苷 Rb1脂质体对脂滴生成的抑制作用更好,50μmol/L的人参皂苷 Rb1 脂 质 体 对 脂 滴 积 聚 的 抑 制 作 用 显 著 大 于200μmol/L游离人参皂苷 Rb1.综上所述,薄膜水和法能够成功制备出谷甾醇修饰对3T3GL1细胞无明显毒副作用的人参皂苷 Rb1脂质体;该脂质体可以抑制成熟脂肪细胞中脂滴积聚,推测具有预防肥胖及相关并发症潜力.

参考文献:

[7]马艺鑫, 宁顺宇, 陈丝, 等. 基于 NG糖基化修饰组学探究人参皂苷 Rb1 改善高脂血症大鼠脂代谢紊乱机制[J]. 中国中西医结合杂志, 2023, 43(9): 1 100G1 107.

[11]卢婧霞, 郑祖国, 徐志猛, 等. 植物甾醇降血脂机制研究进展[J]. 中国中药杂志, 2019, 44(21): 4 552G4 559.

[17]杨艳芳, 谢向阳, 杨阳, 等. 粒径与表面电荷影响脂质体体内药物靶向递送的研究进展[J]. 药学学报, 2013, 48(11): 1 644G1 650.

基金资助:国家自然科学基金项目(编号:31200035);

文章来源:尤晓颜,刘慧,段续,等.人参皂苷Rb_1脂质体的制备及对脂肪细胞中脂滴积聚的抑制作用[J].食品与机械,2024,40(07):1-6+80.