肉桂（Cinnamomum cassia），又名玉桂和桂皮，樟科植物肉桂的干皮和枝皮，具有散寒止痛、抑菌保鲜的功效。肉桂在我国主要分布于福建、广西、广东、云南等地，其中广西、广东最多，占全国产量的95%以上[1]。

近年来，研究表明肉桂多酚具有降低血糖、调节血脂、抗肿瘤、抗氧化等功能，可以降低代谢综合征、糖尿病、心血管疾病的患病危险[1-2]。目前，对于肉桂多酚的提取工艺及生物活性等方面尚缺乏系统的研究。本文旨在探讨超声辅助提取肉桂多酚的工艺条件及其抗氧化与抑菌等生物活性，以期为肉桂多酚在医药和食品等领域的高值化深加工利用提供参考依据。

1、仪器与材料

1.1 仪器

KQ-600DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；TDY-600型离心机（上海安亭科学仪器厂）；UV-5500PC型紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）；YRE2000E型旋转蒸发仪（巩义市予华仪器有限公司）；FD-1A-50型真空冷冻干燥机（上海汉诺仪器有限公司）；SW-CJ-IBU型超净工作台（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；MIX-150BL型霉菌培养箱（黄骅菲斯福实验仪器有限公司）。

1.2 试剂

肉桂产自广东云浮，经广东药科大学中药学院滕希峰博士鉴定为樟科植物肉桂Cinnamomum cassia的干燥树皮；无水乙醇、无水碳酸钠、三氯乙酸、维生素C（天津市致远化学试剂有限公司）；福林酚试剂（国药集团化学试剂有限公司）；没食子酸（上海麦克林生化科技股份有限公司）；1.1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2'-联氮＿双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）、三氯化铁（上海阿拉丁公司）；铁氰化钾（天津福晨化学试剂厂）；水解酪蛋白胨肉汤、技术琼脂粉、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌（广州环凯微生物科技有限公司）。

2、方法

2.1 肉桂多酚超声辅助提取工艺

2.1.1 没食子酸标准曲线的建立

参照文献[3]，配制质量浓度为1.0 mg/mL的没食子酸溶液，分别稀释至质量浓度为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08 mg/mL的溶液。移取上述溶液各1 mL和去离子水1 mL，置于6支试管中，分别加入10%福林酚溶液5.0 mL,3～8 min以内加入7.5%碳酸钠溶液4.0 mL，室温下避光放置120 min,765 nm波长下测定吸光度。根据吸光度与浓度的关系建立回归曲线，得到没食子酸标准曲线。

2.1.2 单因素试验

参照文献[4-6]，以超声功率480W、乙醇体积分数70%、提取时间30 min、液料比30∶1为标准，保持另外3个因素不变，分别调整超声功率为360、420、540、600 W，乙醇体积分数为40%、50%、70%、80%，提取时间为10、20、40、50 min，液料比为20∶1、40∶1、50∶1、60∶1，进行超声提取。离心得到肉桂多酚提取液，稀释后在765 nm处测定提取液吸光度，通过没食子酸标准曲线计算肉桂多酚浓度和提取率。

2.1.3 正交试验

参照文献[7-8]，以乙醇体积分数为因素A、提取时间为因素B、液料比为因素为C，以提取率为考察指标进行正交试验分析，优化肉桂多酚的提取工艺参数，因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平表

2.2 肉桂多酚的纯化与富集

参照文献[9-10]，将预先处理好的D101大孔吸附树脂倒入层析柱中，再将肉桂多酚提取液加入层析柱中，避光，充分接触24 h。向柱中逐滴加入去离子水，直至流出的水澄清。再向层析柱中加入体积分数为70%乙醇溶液，直至流动相无色。

将乙醇提取液在45℃下旋蒸至体积不再减少，再将旋蒸后的提取液进行冷冻干燥，24 h后取出得到纯化多酚，将提取物收集，称定质量。

2.3 肉桂多酚的抗氧化活性测定

2.3.1 DPPH自由基清除实验

参照文献[11]，在5支试管中分别加入2 mL不同浓度5～25μg/mL纯化多酚溶液，再向每支试管中加入0.1 mmol/L DPPH-乙醇溶液2 mL，避光反应30 min，测定吸光度为A1；另取5支试管分别加入2 mL上述浓度的溶液，以无水乙醇代替DPPH-乙醇溶液，测定吸光度为A2；再取试管，加入2 mL的DPPH-乙醇溶液和2 mL的无水乙醇，测定吸光度为A3;30 min后，以无水乙醇为空白，维生素C为阳性对照，在517 nm处测定溶液吸光度，平行3次实验，按以下公式计算DPPH自由基清除率：

2.3.2 ABTS自由基清除实验

参照文献[12-13]，将ABTS溶液（7.0 mol/L）与等体积的过硫酸钾溶液（2.45 mol/L）混合，避光静置12～16 h得到原液。用无水乙醇稀释，使其吸光度为0.7±0.02，作为工作液。在试管中分别加入1 mL不同浓度纯化多酚溶液和3 mL工作液，避光反应6 min；另取试管，分别加入1 mL上述样品溶液和3 mL无水乙醇，避光反应6 min；另取试管，加入1 mL无水乙醇和3 mL工作液，在734 nm测定上述溶液吸光度A1、A2、A3，平行3次实验。根据以下公式计算ABTS自由基清除率：

2.3.3 还原力实验

在5支10 mL试管中分别加入2.5 mL不同浓度的纯化多酚溶液，再分别加入2.5 mL0.1 mol/L PBS溶液（pH6.6）和质量浓度1%的铁氰化钾溶液，混合均匀后，在50℃孵育20 min。冲洗冷却至室温后，加入2.5 mL三氯乙酸溶液，充分反应后，5 000 r/min离心10 min。取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸馏水，0.5 mL三氯化铁溶液，静置10 min。测定在700 nm下的吸光度为Ai。再分别取上述浓度的样品溶液2.5 mL，并加入2.5 mL PBS溶液和铁氰化钾溶液，混合均匀后，在50℃下孵育20 min。流水冲洗冷却至室温后，加入2.5 mL三氯乙酸，充分反应后5 000 r/min离心10 min。取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸馏水，静置10 min。测定其在700 nm下的吸光度为A0，平行测定3次，维生素C为阳性对照，根据公式“还原力=Ai-A0”计算还原力。

2.4 肉桂多酚的抑菌活性测定

2.4.1 细菌悬浮液配制及菌种复苏活化

参照文献[14-15]，将5.25 g水解酪蛋白胨肉汤和2.125 g技术琼脂粉与250 mL蒸馏水加热直至溶解后，在高温下灭菌26 min。培养基降温至50℃时，超净台中倒20 mL培养液在培养皿中。将铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌，分别置于5种不同的营养肉汤培养基中。

2.4.2 抑菌活性测定

用滤纸扩散法测定肉桂多酚对细菌的抑制效果。将直径为6 mm滤纸片浸泡在40%乙醇溶液配制成的30 mg/mL纯化多酚溶液中2 h，培养皿保持在37℃下24 h。以质量浓度为30μg/mL的左氧氟沙星溶液为阳性对照，体积分数为40%乙醇溶液为阴性对照，平行2次实验。观察不同质量浓度的肉桂多酚溶液的抑菌圈大小情况，并与阴性对照和阳性对照结果进行比较。

2.4.3 MIC和MBC的测定

使用无菌的体积分数40%乙醇溶液（含0.8%的DMSO），将纯化多酚稀释成16 mg/mL，采用二倍稀释法，将纯化多酚溶液稀释至0.062 5μg/mL，加入50μL细菌溶液。将96孔板放置在37℃的培养箱中培养16 h，每孔加入0.2 g/L的碘硝基四唑紫20μL，混匀，在37℃的培养箱中培养6 h，明显变色的第1个孔所对应的样品浓度即为最低抑菌浓度（MIC）。

称取2.715 g的技术琼脂粉、6.93 g水解酪蛋白胨肉汤，加入250 mL蒸馏水，边搅拌边加热至溶解。在高温下灭菌26 min。降温至约50℃时，于无菌超净台中倒20 mL培养液在培养皿中。将96孔板中所有没有出现变色的孔中吸取50μL液体到上述固体培养基中涂布均匀，再放入37℃的培养箱中培养24 h，观察培养基中是否有细菌生长，完全没有细菌生长的培养皿对应的浓度即为最低杀菌浓度（MBC）。以10μg/mL的左氧氟沙星溶液为阳性对照。

3、结果与分析

3.1 肉桂多酚超声辅助提取工艺

3.1.1 没食子酸标准曲线的建立

线性回归方程为y=10.946 x+0.043 4,R2=0.999，表明没食子酸质量浓度在0.01～0.08 mg/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系。

3.1.2 单因素试验

从图1A可见，随着乙醇体积分数增大，肉桂多酚提取率呈现先升高后下降的趋势，其中60%乙醇和70%乙醇相差不大。这可能与肉桂多酚的极性大小有关系，考虑到试验成本和提取率，乙醇体积分数选择60%。从图1B可见，肉桂多酚提取率随液料比的增大呈现先升高后下降的趋势，原因可能是溶剂体积增大到一定程度时，单位体积上超声波的能量会减少，从而导致肉桂多酚提取率显著下降，因此液料比确定为30∶1。从图1C可见，肉桂多酚提取率随超声辅助提取功率的增大呈现先升高后下降的趋势，其原因可能是随着超声功率的增大，超声强度（功率密度）也增强，多酚结构有可能会被增大的超声强度破坏而分解，从而导致肉桂多酚的提取率降低，当在功率达到480 W以后的多酚提取率不断下降，因此超声辅助提取功率选择480 W。从图1D可见，肉桂多酚提取率随超声辅助提取时间的延长呈现先上升后下降的趋势，超声时间的延长加剧了肉桂组织的破碎程度，使得组织内部的多酚向周围溶剂扩散的速度提高，进而提高提取率。而超声辅助提取时间过长可能会导致多酚裂解为碎片，造成肉桂多酚提取率降低。因此，超声时间确定为30 min。

图1 各单因素条件对肉桂多酚提取率的影响

3.1.3 正交试验

从表2—3可见，影响肉桂多酚提取效果的因素排列顺序为提取时间>乙醇体积分数>液料比，说明提取时间对于提取效果的影响最大，液料比对于提取效果的影响最小，但是各因素的影响均无统计学意义。分析可能有以下原因：肉桂多酚的含量过低，乙醇体积分数、超声辅助提取时间和液料比3个因素对提取率的影响均有限，且肉桂多酚具有一定的抗氧化作用，容易被空气中的氧气或其他物质氧化，从而影响提取率。综上，确定最佳组合方案是A3B2C2，即：乙醇体积分数为70%，提取时间为30 min，液料比为30∶1。

3.1.4 最佳工艺验证试验

单因素试验和正交试验的优化结果为：乙醇体积分数70%、时间30 min、液料比30∶1，在该最优工艺条件下，重复3次实验的提取率分别为4.039%、3.808%、3.929%，平均值为3.920%。

3.2 肉桂多酚的纯化与富集

原料肉桂粉100 g，得多酚提取物质量为3.444 g，提取物收率为3.44%，提取物中多酚质量分数为39.08%，肉桂多酚得率为1.34%。

3.3 肉桂多酚的抗氧化活性

从图2可见，肉桂多酚对DPPH、ABTS自由基的清除率和还原力随浓度的增大而增强。与阳性对照相比其对DPPH、ABTS自由基有良好的清除力，但还原力较弱，且随浓度增大而缓慢增强。

表2 正交试验结果

表3 方差分析结果

图2 抗氧化活性实验结果

3.4 肉桂多酚的抑菌活性

从表4、图3可见，肉桂多酚对乙型副伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌均具有显著的抑制作用。根据抑菌环直径、MIC和MBC可知，其对乙型副伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌的抑菌效果弱于金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌，据此推测肉桂多酚对革兰阳性细菌的抑菌活性优于革兰阴性细菌。

抑菌圈直径越大、MIC和MBC的浓度越小，代表物质的抑菌能力越强。肉桂多酚的抑菌圈直径小于左氧氟沙星，MIC和MBC远大于左氧氟沙星，证明其抑菌和杀菌能力弱于左氧氟沙星。

表4 肉桂多酚抑菌活性实验结果

图3 肉桂多酚（a）、左氧氟沙星（b）和40%乙醇（c）对5种细菌的抑菌效果

4、结语

肉桂是药食两用的植物，在我国分布较广，资源丰富。肉桂多酚具有抗炎、抗肿瘤、降血糖等多种药理作用[16]。有研究表明，肉桂水提物中总多酚的含量与肉桂活性以及提取工艺条件有关。超声波辅助提取技术具有提取效率高、节约能源以及环保等优点，广泛应用于提取热不稳定活性物质和要求低温加工的食品。本文对超声提取肉桂中多酚的工艺进行了探讨，考察了乙醇体积分数、液料比、提取时间和超声功率等因素对肉桂多酚提取率的影响，采用正交设计法优选最佳提取工艺条件，在此最优工艺条件下，肉桂中多酚的提取率为3.92%；同时，抗氧化、抑菌活性实验结果表明，肉桂多酚具有良好的抗氧化、抑菌活性。

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基金资助:广东省级大学生创新创业训练计划项目(202210573030); 广东省科技厅-农村科技特派员团队项目(KTP20200170); 云浮市中医药南药创新团队项目[云科函[2022]71号];

文章来源:许家豪,李若仪,黄麟桀,等.肉桂多酚超声辅助提取工艺优化及其抗氧化､抑菌活性研究[J].广东药科大学学报,2024,40(04):53-58.