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赣南野生黄花倒水莲抗炎作用及其作用机制的初步研究

2024-08-08 113 上传者：管理员

摘要：目的分析赣南野生黄花倒水莲抗炎作用及其作用机制。方法提取黄花倒水莲总黄酮后取对数生长期的RAW264.7细胞，分为空白对照组(以无血清DMEM孵育)、模型组(加入脂多糖100μg/L孵育24 h)及低、中、高剂量总黄酮组，ELISA方法测定一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素(IL)-1α、IL-1β、IL-6、IL-10含量，Western blot法检测细胞中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、环氧合酶-2(COX-2)蛋白相对表达。应用对角叉菜胶致大鼠足肿胀模型，分为模型组(灌胃蒸馏水)、阳性对照组(灌胃给予阿司匹林)、低、中、高剂量总黄酮组，各组分别以0.2、2、20μmol/L的黄花倒水莲总黄酮提取物灌胃，连续给药5 d,观察各组大鼠足跖肿胀度及大鼠血清iNOS、COX-2、TNF-α、IL-1β水平。应用冰醋酸致大鼠腹腔毛细血管通透性模型，观察各组大鼠伊文斯蓝含量及毛细血管抑制通透性率。结果与空白对照组比较，模型组RAW264.7细胞NO、TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6水平升高，IL-10水平降低(P<0.01);与模型组比较，低剂量总黄酮组、中剂量总黄酮组及高剂量总黄酮组NO、TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6水平降低，IL-10水平依次升高(P<0.05)。与空白对照组比较，模型组iNOS、COX-2蛋白相对表达量升高(P<0.05);与模型组比较，低剂量总黄酮组、中剂量总黄酮组及高剂量总黄酮组iNOS、COX-2蛋白相对表达量依次降低(P<0.05)。与模型组比较，阳性对照组、中剂量总黄酮组致炎成功后1、3 h及高剂量总黄酮组致炎成功后1、2、3 h的大鼠足跖肿胀度均降低(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较，阳性对照组、低剂量总黄酮组、中剂量总黄酮组及高剂量总黄酮组血清iNOS、COX-2、TNF-α、IL-1β水平均依次降低(P<0.01)。与模型组比较，阳性对照组、低剂量总黄酮组、中剂量总黄酮组及高剂量总黄酮组腹膜毛细血管伊文斯蓝含量均降低(P<0.05或P<0.01);阳性对照组、低剂量总黄酮组、中剂量总黄酮组及高剂量总黄酮组腹膜毛细血管抑制率均增加(P<0.05或P<0.01)。结论赣南野生黄花倒水莲总黄酮可有效发挥抗炎作用，抑制大鼠角叉菜胶所致足趾肿胀程度，降低大鼠腹腔毛细血管通透性，具有良好的市场发展前景和社会效益。

关键词：
总黄酮
炎性因子
腹腔毛细血管通透性
赣南
野生黄花倒水莲花
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黄花倒水莲是一种睡莲科水生植物，通常生长在湖泊、池塘、河流等水域浅滩的淤泥中[1]。据古书记载黄花倒水莲味道甘甜微苦，性质温和平和，有益于滋补气血、增进脾胃功能、调节血液循环等[2]。近年来，黄花倒水莲的抗炎及抗氧化等作用逐步被人们所认知。黄花倒水莲中的总黄酮类化合物具有抗氧化、抗炎及抗菌等生物活性[3]。黄花倒水莲中包括黄芩苷、黄芩素、芒柄花素及其他一些黄酮类物质，可发挥抗氧化、抗炎及抗菌等生物活性，具有较好药用价值[4-5]。本研究通过提取赣南地区黄花倒水莲中总黄酮，通过体外抗炎实验，观察黄花倒水莲总黄酮体外抗炎及其作用机制，通过对角叉菜胶致大鼠足肿胀的影响和对冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增加的影响实验，分析黄花倒水莲总黄酮体内抗炎及其作用机制，报道如下。

1、材料与方法

1.1 实验材料、试剂及仪器

中药粉碎机(常州市涌锦干燥设备有限公司)、恒温水浴锅(河南沃林仪器设备有限公司)、RAW264.7细胞(上海联祖生物科技有限公司)、胰蛋白酶(北京白普赛斯生物科技有限公司)、角叉菜胶(上海麦克林生物科技有限公司)、PBS洗涤液(上海莼试生物科技有限公司)、脂多糖(上海西格玛奥德里奇贸易有限公司)、足容积测量器(北京美华仪科技有限公司)、伊文斯蓝生理盐水(上海泽叶生物科技技术有限公司)、冰醋酸(山东锦礼化工有限公司),全自动酶标仪(北京质研科技有限公司)。

1.2 黄花倒水莲总黄酮的提取

选取赣南地区野生黄花倒水莲干燥后用粉碎机粉碎，按料药比为1∶30,加入80%乙醇溶液，在45 ℃恒温水浴锅内连续浸提2次，每次4 h, 过滤提取液，减压浓缩和冷冻干燥后即得黄花倒水莲总黄酮的提取物。

1.3 黄花倒水莲总黄酮提取物对体外炎性指标的影响

取对数生长期的RAW264.7细胞，0.25 g/L胰蛋白酶EDTA消化，接种于细胞培养瓶中，分为5组，分别为空白对照组(以无血清DMEM孵育)、模型组(加入脂多糖100 μg/L孵育24 h)及低、中、高剂量总黄酮组，处理细胞2 h后，再加入脂多糖孵育24 h, 取细胞上清液，测定一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素(IL)-1α、IL-1β、IL- 6、IL-10含量。分组处理后的细胞用冰PBS洗涤，加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂后收集细胞，超声破碎后进行离心处理，取上清液待测定含量，用Western Blot法检测细胞中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、环氧合酶-2(COX-2)蛋白相对表达。

1.4 黄花倒水莲总黄酮提取物对体内炎性指标的影响

黄花倒水莲总黄酮提取物对角叉菜胶致大鼠足肿胀的影响及其机制研究实验分为模型组(蒸馏水灌胃)、阳性对照组(阿司匹林灌胃)、低、中、高剂量总黄酮组，各组分别以0.2、2、20 μmol/L的黄花倒水莲总黄酮提取物灌胃，连续给药5 d, 末次给药后测定右足趾致炎前体积，末次给药后30 min, 于各组大鼠右后足跖皮下注射1%角叉菜胶0.1 ml致炎，在致炎后3 h用足容积测量器测定右足趾致炎后体积，按公式计算足跖肿胀度：足跖肿胀度=(致炎后足容积-致炎前足容积)/致炎前足容积×100%。测定完后处死大鼠取全血3 000 r/min离心5 min, 取上层血清置于4 ℃冰箱中冷藏备用，测定血清中iNOS、COX-2含量。剪下大鼠炎症右后足，称重，以预冷的生理盐水为匀浆介质，制备成10%组织匀浆，4 ℃,3 000 r/min离心15 min, 取上清液，测定TNF-α、IL-1β水平。

1.5 黄花倒水莲总黄酮提取物对冰醋酸致大鼠腹腔毛细血管通透性的影响

实验分为模型组(蒸馏水灌胃)、阳性对照组(阿司匹林灌胃)、低、中、高剂量总黄酮组，各组分别以0.2、2、20 μmol/L的NP总黄酮提取物灌胃，连续给药5 d, 末次给药1 h后，尾静脉注射0.5%伊文斯蓝生理盐水，并腹腔注射0.7%冰醋酸，致炎30 min后，处死小鼠，腹腔注射5 ml生理盐水，剪开腹腔，收集腹腔液离心后，取上清液于590 nm处以生理盐水为对照调零，比色测定吸光度OD值，以OD值表示伊文斯蓝含量，反映腹腔毛细血管通透性。抑制率=(空白组平均吸光度-给药组平均吸光度)/空白组平均吸光度×100%。

1.6 统计学方法

应用SPSS 26.0进行统计学分析，多组间比较用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 黄花倒水莲总黄酮提取物对RAW264.7细胞NO、炎性因子的影响

与空白对照组比较，模型组RAW264.7细胞NO、TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL- 6水平升高，IL-10水平降低(P<0.01);与模型组比较，低剂量总黄酮组、中剂量总黄酮组及高剂量总黄酮组NO、TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL- 6水平依次降低，IL-10水平依次升高(P<0.05),见表1。与空白对照组比较，模型组iNOS、COX-2蛋白相对表达量升高(P<0.05);与模型组比较，低剂量总黄酮组、中剂量总黄酮组及高剂量总黄酮组iNOS、COX-2蛋白相对表达量依次降低(P<0.05),见图1。

2.2 黄花倒水莲总黄酮提取物对大鼠角叉菜胶所致足趾肿胀及血清iNOS、COX-2、TNF-α、IL-1β的影响

与模型组比较，阳性对照组、中剂量总黄酮组致炎成功后1、3 h及高剂量总黄酮组致炎成功后1、2、3 h的大鼠足跖肿胀度均依次降低(P<0.05或P<0.01),见表2。与模型组比较，阳性对照组、低剂量总黄酮组、中剂量总黄酮组及高剂量总黄酮组血清iNOS、COX-2、TNF-α、IL-1β水平均依次降低(P<0.01),见表3。

表1各组NO、炎性因子水平比较

图1黄花倒水莲总黄酮提取物对RAW264.7细胞iNOS、COX-2蛋白相对表达的影响

表3各组血清iNOS、COX-2、TNF-α、IL-1β水平比较

表2各组大鼠足趾肿胀度比较

2.3 黄花倒水莲总黄酮提取物对冰醋酸致大鼠腹腔毛细血管通透性的影响

与模型组比较，阳性对照组、低剂量总黄酮组、中剂量总黄酮组及高剂量总黄酮组腹膜毛细血管伊文斯蓝含量均降低(P<0.05或P<0.01);阳性对照组、低剂量总黄酮组、中剂量总黄酮组及高剂量总黄酮组腹膜毛细血管抑制率均增加(P<0.05或P<0.01),见图2。

图2黄花倒水莲总黄酮提取物对冰醋酸致大鼠腹腔毛细血管通透性的影响

3、讨论

黄花倒水莲具有补气血、健脾、利湿活血等功效，主要成分为黄酮类、皂苷类、多糖类等，其根、茎、叶、花均可入药。有大量研究表明黄花倒水莲根、茎水提取物及其黄花倒水莲总黄酮具有抗炎作用[6- 8]。谢伟容等[9]报道黄花倒水莲根、叶提取物对四氯化碳致小鼠急性肝损伤有明显的保护作用，可改善血清ALT、AST水平，改善肝组织病理损伤。何灵芝等[10]研究表明黄花倒水莲总黄酮中剂量组对小鼠耳肿胀抑制率达56.46%,具有明显抗炎作用。目前，关于黄花倒水莲的研究主要集中在根、茎、叶的化学成分和药理作用，黄花倒水莲花的化学成分及药理作用研究报道极少见，有研究表明黄花倒水莲花中具有黄酮成分。因此，黄花倒水莲花中总黄酮提取物是否具有抗炎作用值得探究。

NO在人体免疫系统发挥重要作用，参与多种炎性反应及免疫反应过程。检测NO水平可常作为炎症和免疫相关疾病的辅助诊断重要指标。总黄酮作为植物中重要的抗氧化剂，有助于减少氧化应激对人体健康的不利影响，减少细胞氧化损伤、降低慢性疾病风险、延缓细胞衰老过程[11]。王灿等[12]研究证实，总黄酮可刺激体内超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性，增强细胞对抗氧化应激能力。TNF-α是一种重要的炎性递质，参与炎性反应过程中的细胞信号传导和炎性细胞的活化[13]。总黄酮可调节炎性因子释放，减少TNF-α等促炎因子生成，从而抑制炎性反应。此外，TNF-α在免疫调节中能激活免疫细胞、介导炎性反应[14]。总黄酮可能通过调节免疫细胞活性、影响细胞信号传导等方式，抑制TNF-α释放和其对免疫系统的影响。IL-1α和IL-1β是2种重要的炎性因子，均属于IL-1家族的成员，参与了调节免疫反应和炎性反应过程。总黄酮可抑制IL-1α和IL-1β的产生和释放，参与调节炎性反应、免疫应答和细胞增殖。总黄酮可能通过抑制信号传导途径或减少炎性递质合成影响这2种因子释放，从而调节炎性反应过程[15]。IL- 6是一种多功能的细胞因子，在免疫和炎性反应调节中发挥重要作用，其能促进炎性反应、调节免疫细胞增殖和活化，参与急性和慢性炎性反应的发生和发展，同时也与体内代谢、组织修复等过程相关。IL-10在免疫调节中具有重要抗炎作用，能抑制炎性反应、调节免疫细胞活性，减少炎性递质的释放和降低炎性反应强度，有助于维持免疫系统的平衡和稳定。王蒙蒙等[16]研究证实，总黄酮可通过多种途径调节IL- 6的产生，有研究表明总黄酮能抑制IL- 6释放。本研究也证实黄花倒水莲中的总黄酮可有效抑制体外RAW264.7细胞的氧化及炎性因子，发挥良好的抗炎作用。IL-10被认为是一种抗炎因子，能抑制炎性反应，减轻炎性损伤。总黄酮对IL-10的影响更多地表现为促进作用，其通过调节IL-10的合成与释放发挥炎性反应调节作用[17]。iNOS是一种酶类蛋白质，参与机体内产生NO过程，NO是一种重要生物信号分子，参与多种炎性反应的生理及病理过程。血清iNOS水平可作为一种生物标志物，在疾病诊断和评估方面具有一定潜在价值。总黄酮在抑制炎性反应过程中可影响iNOS表达和活性，通过抑制炎症信号通路、减少炎性因子释放等途径，从而降低iNOS的表达水平[18]。毛细血管通透性增加在炎性反应中扮演重要角色，促进了炎性递质和免疫细胞的渗透至受损组织，为炎性反应的进行提供条件。总黄酮可有效降低炎性反应过程，减轻组织损伤和水肿等炎症相关症状。本研究也证实总黄铜可有效抑制大鼠角叉菜胶所致足趾肿胀程度，降低大鼠腹腔毛细血管通透性。

综上所述，赣南野生黄花倒水莲花总黄酮可有效发挥抗炎作用，抑制大鼠角叉菜胶所致足趾肿胀程度，降低大鼠腹腔毛细血管通透性，具有良好的市场发展前景和社会效益。

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