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山蜡梅叶挥发油抑菌喷雾剂的皮肤刺激性及过敏性评价研究

2024-08-13 100 上传者：管理员

摘要：目的：探究山蜡梅叶挥发油抑菌喷雾剂对皮肤的刺激性和过敏性。方法：对山蜡梅叶挥发油抑菌喷雾剂进行家兔单次给药皮肤刺激试验和多次给药皮肤刺激试验，并于多次给药后取受试部位进行皮肤病理组织检查。同时采用豚鼠进行皮肤过敏性试验。结果：单次给药后，家兔的受试皮肤未见明显异常。多次给药期间，部分家兔出现轻度红斑，其余家兔无明显异常。病理组织检查显示山蜡梅叶挥发油抑菌喷雾剂多次给药后对皮肤无刺激作用。皮肤过敏性试验未引起豚鼠皮肤过敏反应。结论：山蜡梅叶挥发油抑菌喷雾剂无皮肤刺激性及过敏性。

关键词：
山蜡梅
抑菌喷雾剂
挥发油
皮肤刺激性
皮肤过敏性
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山蜡梅叶为蜡梅科植物山蜡梅Chimonanthus nitens Oliv.的干燥叶，具有祛风解表、清热解毒、醒脾化浊之功效[1]。山蜡梅叶挥发油富含芳樟醇和桉叶油醇等活性成分[2]，有较强的抗菌、抗炎、镇咳平喘作用。研究表明，山蜡梅叶挥发油可作为一种天然抑菌剂，对产气肠杆菌、黑曲霉、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等均有不同强度的抑菌效果[3-6]。因此以山蜡梅叶挥发油作为原材料制备成抑菌喷雾剂，具有良好的应用前景和市场价值。而抑菌喷雾剂作为中药类外用药物，在使用过程中制剂的挥发油、辅料成分等都有可能会引起皮肤的刺激性和过敏性反应。本文以新西兰兔为模型，通过刺激反应评分结合病理切片HE染色法探究皮肤刺激性试验，以及以豚鼠为模型研究皮肤过敏性试验，以提示应用中可能出现的毒性反应、监测指标等，探讨该抑菌喷雾剂对皮肤的刺激性和过敏性。

1、材料

1.1 动物

新西兰兔16只，体重2～2.5 kg，雌雄各半，购自江西科瑞斯生物科技有限公司，动物生产许可证号：SYXK（赣）2017-0004。普通豚鼠30只，体重260～300 g，雄性，购自江西科瑞斯生物科技有限公司，动物生产许可证号：SYXK（赣）2017-0004。

1.2 试剂

山蜡梅叶挥发油抑菌喷雾剂（实验室自制）：按照处方工艺，挥发油7.03%与蓖麻油聚氧乙烯醚13.48%混匀后加入乙醇3.82%，缓慢加入蒸馏水75.67%即得；空白喷雾剂（实验室自制）：除不加主药外，按照处方工艺及比例制备即得；山腊梅叶挥发油（江西省佑美制药有限公司，批号210524）；无水乙醇（西陇科学股份有限公司，批号2010299）；蓖麻油聚氧乙烯醚（上海易恩化学技术有限公司，批号RH277508）；硫化钠（上海阿拉丁生化科技有限公司，批号D2110332);2,4-二硝基氯苯（上海贤鼎生物科技有限公司）。

2、方法

2.1 皮肤刺激性试验

2.1.1 家兔皮肤的准备

取健康家兔于试验前24 h进行背部脱毛处理（8%Na2S脱毛，去毛范围左、右各3 cm×3 cm），给药前应检查皮肤是否因脱毛而受损伤，有皮肤刮伤的动物不宜继续进行试验。进行破损皮肤的刺激性研究时，在用药部位用砂纸磨或用针头划“#”字并以渗血为度。

2.1.2 分组与给药

将符合要求的家兔随机分成4组，各4只，雌雄各半，处理如下：（1）完整皮肤实验组：涂抑菌喷雾剂0.5 mL;(2）完整皮肤辅料组：涂空白喷雾剂0.5 mL;(3）破损皮肤实验组：涂抑菌喷雾剂0.5 mL;(4）破损皮肤辅料组：涂空白喷雾剂0.5 mL。

2.1.3 单次给药皮肤刺激性试验

参照《中药、天然药物刺激性和溶血性研究的技术指导原则》[7]，采用同体左右侧自身对照法，将抑菌喷雾剂或者空白喷雾剂均匀涂抹于家兔脱毛区左侧，右侧涂生理盐水，单独饲养，4 h后用生理盐水去除药物。于给药后4、24、48、72 h观察家兔的皮肤反应，用皮肤刺激强度标准对皮肤有无红斑和水肿等情况进行判断。

2.1.4 多次给药皮肤刺激性试验

参照指导原则，采用同体左右侧自身对照法，将抑菌喷雾剂或者空白喷雾剂均匀涂抹于家兔脱毛区左侧，另一侧生理盐水做对照，贴敷时间至少4 h。贴敷结束后，用生理盐水去除药物。每隔24 h给药一次，连续7 d。每次给药之后观察并记录皮肤红斑、水肿等反应及其消退情况，用皮肤刺激强度标准进行判断。实验观察结束后，剪取家兔的脱毛区皮肤进行病理组织学检查。

2.1.5 HE染色观察皮肤病理组织状态

参考文献[8]和[9]，修改方法：给药结束后，取适当的皮肤组织置于4%多聚甲醛内固定24 h，然后按照常规步骤对组织进行脱水、透明、浸蜡、包埋、切片和烤片。将处置好的皮肤组织适当调整大小，以符合适合包埋大小为佳。依次将切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中，各20 min，在不同浓度下的乙醇（100%、95%、85%、75%）中浸泡各5 min，然后蒸馏水洗；切片置入苏木精液染色3～6 min后用流水洗净，接着加入1%盐酸乙醇溶液分色5 s，用1%氨水浸洗返蓝，用流水冲洗；将切片按照顺序依次放入85%乙醇和95%乙醇脱水各5 min，随后用伊红染液对切片染色5 min，然后依次放入100%乙醇I、100%乙醇II和100%乙醇Ⅲ中，浸泡各5 min，在二甲苯Ⅰ、Ⅱ中浸泡各10 min，最后用中性树胶进行封固。分别将封固好的切片置于显微镜下，观察皮肤的显微结构，在200倍镜下拍摄采集照片并进行分析。

2.1.6 皮肤刺激的评价标准

皮肤刺激性的评价标准一般体现在皮肤的红斑及水肿程度，在皮肤刺激性试验的各个观察时间点，按照皮肤刺激反应评分标准（表1），对家兔皮肤的红斑及水肿程度进行评分，计算每一观察点各组积分均值，进行皮肤刺激强度评价，评分<0.5为无刺激性，0.5≤评分<3为轻度刺激性，3≤评分<6为中度刺激性，评分≥6为重度刺激性。按照皮肤刺激强度评价标准进行判断该抑菌喷雾剂及空白喷雾剂对皮肤的刺激强度。

表1 皮肤刺激反应评分标准

2.2 皮肤过敏试验

豚鼠皮肤脱毛同“2.1.1”项正常皮肤脱毛。

2.2.1 豚鼠皮肤的准备

2.2.2 分组与给药

将符合要求的豚鼠随机分成3组，每组10只，各组处理如下。（1）实验组：涂抑菌喷雾剂0.5 mL;(2）辅料对照组：涂空白喷雾剂0.5 mL;(3）阳性对照组：涂抹2,4-二硝基氯苯液0.5 mL。

2.2.3 皮肤过敏性实验

参照《中药、天然药物免疫毒性（过敏性、光变态反应）研究技术指导原则》[10]，取抑菌喷雾剂0.5 mL涂在豚鼠的左侧脱毛区（致敏区），另一侧做自身阴性对照，涂0.5 mL的生理盐水，充分保证其在皮肤停留时间持续为6 h，然后于24、48、72 h内观察皮肤过敏情况。第7天和第14天，以相同方法步骤局部给药分别重复一次。阳性对照组、辅料对照组方法同实验组，于末次给药致敏后14 d（第28天），将抑菌喷雾剂100μL涂于豚鼠脱毛区（激发区），6 h后用生理盐水清洗去除药物，即刻观察，然后于24、48、72 h内观察皮肤过敏情况。

2.2.4 皮肤过敏试验结果评价

按表2记录各组别各时间的平均分值，同时密切观察豚鼠是否有全身性过敏反应，如哮喘、站立不稳或休克等现象。根据实验组和对照组动物皮肤过敏反应的差别，判断抑菌喷雾剂是否对皮肤造成过敏性反应，并计算致敏发生率，即将出现皮肤红斑、水肿或全身过敏反应的动物例数（不论程度轻重）除以受试物总数。

0<致敏发生率≤10%为无致敏性，10%<致敏发生率≤30%为轻度致敏性，30%<致敏发生率≤60%为中度致敏性，60%<致敏发生率≤80%为高度致敏性，致敏发生率>80%为极度致敏性。

表2 皮肤过敏反应程度的评分标准

3、结果

3.1 皮肤刺激性实验

3.1.1 单次给药皮肤刺激性实验

单次给药皮肤刺激实验结果显示，对完整皮肤的家兔而言，实验组（抑菌喷雾剂）、辅料组（空白喷雾剂）对家兔的刺激评分均为0，按照表1的评判标准，实验组和辅料组对完整皮肤的家兔无刺激性。对于破损皮肤、实验组（抑菌喷雾剂）和辅料组对家兔的刺激评分均为0，表明抑菌喷雾剂和空白喷雾剂对皮肤无刺激性。

3.1.2 多次给药皮肤刺激性实验

对于完整皮肤而言，实验组家兔在7 d实验期间均未出现红斑和水肿现象，表明抑菌喷雾剂对皮肤无刺激性。辅料组部分家兔在第7天给药后出现轻度红斑，但7 d内刺激强度评分为0.07，表明空白喷雾剂对皮肤无刺激性。对于破损皮肤而言，实验组部分家兔在第3天和第5天出现轻度红斑，但均在24 h后消失，7 d内刺激强度评分为0.07，表明抑菌喷雾剂对皮肤无刺激。辅料组部分家兔在第4天出现轻度红斑、无水肿现象，7 d内刺激强度评分为0.04，表明空白喷雾剂对皮肤无刺激性。综上所述，抑菌喷雾剂和空白喷雾剂对皮肤均无刺激性。见表3、表4。

表3 多次给药皮肤刺激性试验评分结果

表4 多次给药皮肤刺激强度评分结果

3.1.3 HE染色结果分析

家兔经过多次给药皮肤刺激后，取下受试部位进行病理组织HE染色观察，皮肤病理组织切片见图1。在200倍镜观察下：完整皮肤生理盐水组皮肤结构完整，各层清晰可见，表皮各皮层排列整齐、致密，角质层细胞间隙较小，真皮部位的胶原纤维和弹性纤维形态正常。完整皮肤辅料对照组和实验组皮肤整体结构与完整，角质层略微增厚，但无中性粒细胞、炎性细胞浸润和血管扩张等组织病理学变化，与完整皮肤生理盐水组皮肤结构相差无异。破损皮肤生理盐水组角质层有轻微断裂现象，这可能是人为制造破损皮肤时的严重划痕。局部真皮内炎细胞浸润，有少量痂皮形成，属于正常皮肤破损后愈合的正常状况，并非药物或者生理盐水对皮肤的刺激作用。破损皮肤辅料对照组和实验组角质层略微增厚，但未见严重组织病理学改变，同破损皮肤生理盐水组的皮肤结构相比无明显差异。上述结果表明，抑菌喷雾剂对家兔皮肤无刺激性，安全性较高。

图1 经HE染色的家兔皮肤病理组织切片（200×）

3.2 皮肤过敏性实验

实验期间，实验组、辅料对照组、阳性对照组动物进食、行为活动及精神状态等情况均良好。豚鼠皮肤过敏性实验体重变化见表5，实验各组体重组间、组内比较，无统计学差异（P>0.05）。

豚鼠皮肤致敏和激发反应结果见表6、表7，阳性对照组于第1、2、3次致敏后，豚鼠出现了不同程度的红斑、水肿反应。辅料对照组和实验组豚鼠均无出现红斑、水肿现象。末次给药14 d后进行激发，于6 h后去除药物。阳性对照组豚鼠皮肤出现轻度至中度红斑及水肿，且72 h内逐渐减弱，没有出现哮喘、站立不稳或休克等严重的全身性过敏反应，致敏率达到100%。辅料对照组和实验组豚鼠均无红斑、水肿等过敏反应出现，其致敏发生率为0%。以上结果表明，本课题制备的抑菌喷雾剂对皮肤无过敏性。

表5 豚鼠皮肤过敏性实验体重变化(±s,n=10)

表6 豚鼠皮肤致敏反应评分（n=10）

表7 豚鼠皮肤过敏性反应评价结果(n=10)

4、讨论

本研究结果表明，抑菌喷雾剂和空白喷雾剂对家兔的正常皮肤和破损皮肤均无刺激性。皮肤病理组织切片HE染色结果显示，与完整皮肤生理盐水组相比，完整皮肤辅料对照组和实验组的皮肤整体结构完整，真皮层正常，角质层略微增厚，但是无组织病理学改变。破损皮肤辅料对照组和实验组与破损皮肤生理盐水组相比，区别在于角质层略微增厚，其他无明显差异。故认为本研究抑菌喷雾剂未发现明显刺激性反应。

豚鼠皮肤过敏性实验研究结果表明，阳性对照组在致敏期于清洗给药后6 d可见较为明显的红斑，少部分豚鼠出现轻微水肿现象，24 h内仍存在。激发给药后该组所有豚鼠均出现红斑、水肿反应，在72 h后部分豚鼠仍存在过敏状态。而辅料对照组和实验组在致敏期和激发期均无过敏反应发生，故认为抑菌喷雾剂暂未发现明显过敏性反应。

综上所述，山蜡梅叶挥发油抑菌喷雾剂对皮肤无明显刺激性和过敏性，这为抑菌喷雾剂的应用开发奠下了坚实的基础。

参考文献:

[2]李莎莎,舒任庚.山腊梅化学成分及药理作用的研究进展[J].华西药学杂志,2009,24(2):198-200.

[3]刘祝祥,贺建武,彭德娇,等.腊梅叶挥发性成分及其抑菌活性研究[J].湖南农业科学,2011(1):75-77.

[4]刁军成,伍学洲,丁舸.山腊梅叶消毒抑菌的实验研究[J].江西中医药,2002,33(6):35.

[5]刘易鑫,颜日明,鲁顺保,等.突托蜡梅叶中挥发油成分及其抑菌活性研究[J].中国中药杂志,2011,36(22):3149-3154.

[7]国家食品药品监督管理局药品审评中心.中药､天然药物局部刺激性和溶血性研究技术指导原则[S].北京:国家食品药品监督管理局药品审评中心,2005:11-20.

[8]杨晔.多模态图像融合TRUS活检在前列腺癌诊断中的应用及其与病灶病理组织学的关系研究[D].沈阳:中国医科大学,2021.

[9]李聪.瓜拉纳丁香精油复合纳米乳的制备及其抗皮肤衰老作用研究[D].南昌:江西中医药大学,2021.

[10]国家食品药品监督管理局药品审评中心.中药､天然药物免疫毒性(过敏性､光变态反应)研究技术指导原则[S].北京:国家食品药品监督管理局药品审评中心,2005:11.

基金资助:江西省重大科技创新平台项目(20203CCD41007); 江西省重大科技研发专项(20194ABC28009); 江西省研究生创新专项(YC2020-S407);

文章来源:万丽君,邢丽媛,杨怡琴,等.山蜡梅叶挥发油抑菌喷雾剂的皮肤刺激性及过敏性评价研究[J].江西中医药,2024,55(08):62-65.