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顶空-气相色谱法测定丹酚酸A原料中树脂有机物残留

2024-08-14 60 上传者：管理员

摘要：目的：建立丹酚酸A原料中树脂残留溶剂(正己烷、苯、甲苯、乙苯、对二甲苯、间二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯)的测定方法，完善质量标准。方法：以聚乙二醇(PEG)为固定液的毛细管柱为色谱柱；起始温度55℃，维持2 min，以5℃/min的速率升温至70℃，维持3 min，再以20℃/min的速率升温至200℃，维持5 min；检测器为FID，检测器温度250℃；进样口温度200℃；顶空瓶平衡温度85℃，平衡时间30 min；柱流速1.5 mL/min，分流比20∶1。结果：9种残留溶剂均能有效分离，在各自限度浓度的80%～120%范围内线性、准确度、精密度良好；回收率均为70%～120%；定量限分别为0.003、0.001、0.007、0.012、0.011、0.011、0.011、0.008、0.026μg/mL；检测限分别为0.001 1、0.000 2、0.002 1、0.003 8、0.003 4、0.003 4、0.003 2、0.002 6、0.008 0μg/mL。3批中试样品中树脂残留均未检出。结论：该方法专属性、精密度、准确度等均符合要求，可用于测定丹酚酸A原料中的树脂残留。

关键词：
丹酚酸A
树脂残留
气相色谱法
药理药效
质量标准
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丹酚酸A是在研中药1类创新药注射用丹酚酸A的原料药，拟开发用于治疗脑卒中疾病的药物[1-2]。近年来，关于丹酚酸A的报道主要集中在药理药效方面[3-5]。前期课题组报道了制备高纯度丹酚酸A的方法[6]，并对丹酚酸A原料的重金属及有害元素进行了控制[7]。作为中药注射剂的原料，基于“质量源于设计”的理念，在新药质量研究过程中，除关注丹酚酸A原料的纯度、含量外，还应重点关注与安全性紧密相关的质控项目。目前尚无本品树脂残留相关报道，为进一步完善丹酚酸A的质量标准，本试验拟建立树脂残留的检测方法。

本品在制备过程中使用了大孔吸附树脂，根据《中华人民共和国药典》2020年版四部通则[8]和《中药新药质量标准研究技术指导原则（试行）》[9]的要求，在质量标准中应对原料中的树脂残留进行研究。参考课题组其他中药新药树脂残留控制的研究成果[10]，建立了顶空-气相色谱法测定丹酚酸A原料中树脂残留的方法，该方法专属性强，灵敏度、精密度和准确度高。根据研究结果列入了本品质量标准，用于树脂残留的检测，为其他中药注射剂原料药树脂残留的控制提供了参考。

1、仪器与材料

1.1 仪器

Aglient 7890B气相色谱仪（配置FID检测器、顶空进样器）；XS105DU十万分之一电子分析天平。

1.2 试药

丹酚酸A（批号190307、190402、190531);N,N-二甲基甲酰胺（顶空级）；正己烷、苯、甲苯、乙苯、对二甲苯、间二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯（均为色谱级，纯度大于99%）；试验用水为超纯水。

2、方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Agilent HP-INNOWAX(30 m×0.32 mm×0.5µm）；起始温度55℃，维持2 min，以5℃/min速率升温至70℃，维持3 min，再以20℃/min速率升温至200℃，维持5 min；检测器为FID，检测器温度250℃；进样口温度200℃；顶空瓶平衡温度85℃，平衡时间30 min；柱流速1.5 mL/min，分流比20∶1。

2.2 试验方法

2.2.1 空白溶液

以N,N-二甲基甲酰胺水溶液[N,N-二甲基甲酰胺-水（30∶70）]为空白溶液。

2.2.2 混合对照品溶液制备

精密称取正己烷、甲苯、乙苯、对二甲苯、间二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯各100 mg及苯20 mg，置于同一50 mL量瓶中，加N,N-二甲基甲酰胺至刻度，摇匀，再精密量取上述溶液1 mL置100 mL量瓶中，加N,N-二甲基甲酰胺溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品贮备液。

精密量取对照品贮备液10 mL，置100 mL量瓶中，再加N,N-二甲基甲酰胺20 mL，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取5 mL置顶空瓶中，密封，制成每l mL含正己烷、甲苯、乙苯、对二甲苯、间二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯各2μg及苯0.4μg的混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液制备

取本品0.2 g，精密称定，置顶空瓶中，用N,N-二甲基甲酰胺水溶液[N,N-二甲基甲酰胺-水(30∶70)]5 mL使溶解，密封，摇匀，作为供试品溶液。

2.2.4 测定方法

分别精密量取空白溶液、混合对照品溶液和供试品溶液的顶空气体各1 mL，按照拟定色谱条件进行测定，记录色谱图，按外标法计算残留量。

2.3 方法验证

2.3.1 专属性考察

精密吸取上述空白溶液、混合对照品溶液和供试品溶液，按照拟定色谱条件进行测定，记录色谱图。各溶剂峰之间分离度良好（最小分离度1.9），空白溶液、丹酚酸A对树脂残留检测无干扰，方法专属性良好。色谱图见图1。

图1 专属性色谱图

分别取正己烷、苯、甲苯、乙苯、对二甲苯、间二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯各约20 mg，精密称定，分别置20 mL量瓶中，分别用N,N-二甲基甲酰胺逐级稀释，当主峰峰高约为噪音高度的10倍时计算为定量限，当主峰峰高约为噪音高度的3倍时计算为检测限，并分别计算相应的浓度（µg/m L）以及相当于供试品浓度的百分比（%）。供试品浓度为40 mg/mL时，对溶剂的检测灵敏度均能达到拟定限度的要求。结果见表1。

表1 检测限与定量限

2.3.3 线性关系考察

分别精密量取“2.2.2”项下混合对照品贮备液2.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mL，分别置100 mL量瓶中，加N,N-二甲基甲酰胺溶液稀释至刻度，配制成限度浓度20%、60%、80%、100%、120%的对照品溶液；将“2.3.2”项下定量限浓度溶液及20%、60%、80%、100%、120%对照品溶液，作为系列线性溶液（正己烷质量浓度分别为0.003、0.400、1.201、1.602、2.002、2.402µg/m L，苯质量浓度分别为0.001、0.085、0.256、0.341、0.426、0.511µg/m L，甲苯质量浓度分别为0.007、0.409、1.226、1.635、2.044、2.453µg/m L，乙苯质量浓度分别为0.012、0.423、1.270、1.693、2.116、2.539µg/m L，对二甲苯质量浓度分别为0.011、0.396、1.188、1.584、1.980、2.376µg/m L，间二甲苯质量浓度分别为0.011、0.392、1.177、1.570、1.962、2.354µg/m L，邻二甲苯质量浓度分别为0.011、0.405、1.216、1.621、2.026、2.431µg/m L，苯乙烯质量浓度分别为0.008、0.417、1.250、1.667、2.084、2.501µg/m L，二乙烯苯质量浓度分别为0.026、0.408、1.225、1.634、2.042、2.450µg/mL）。按照拟定色谱条件进行测定，以浓度为横坐标，平均峰面积为纵坐标绘制各成分的标准曲线，在不高于100%响应值峰面积的20%，峰面积与浓度线性关系良好。线性回归方程、线性范围及相关系数见表2。

表2 线性回归方程、线性范围及相关系数

2.3.4 精密度试验

取丹酚酸A 200 mg，精密称定，置顶空瓶中，再精密量取对照品溶液5 mL，密封，使溶解，作为供试品溶液。同法配制6份，按照拟定色谱条件测定，并计算RSD。RSD为1.48%～2.90%，均小于10%，说明方法的重复性良好。见表3。

表3 精密度试验（n=6)

2.3.5 准确度试验

精密称取丹酚酸A 2 g，共3份，置50 mL量瓶中，分别进行3个浓度水平（80%、100%、120%）的加标试验，每个浓度水平制备3份，按照拟定色谱条件测定树脂残留含量，计算回收率。各浓度项下的回收率均为70.0%～120.0%,RSD均小于10%，方法准确度良好。见表4。

2.4 样品测定

取3批丹酚酸A中试样品（批号190307、190402、190531）适量，按“2.2.3”制备供试品溶液，按“2.1”色谱条件测定树脂残留。结果显示，3批样品树脂残留均未检出。

3、讨论

3.1 树脂残留标准的制定

本品制备工艺过程中使用了大孔吸附树脂，树脂残留暴露量的多少关系药品的安全性。根据丹酚酸A制备工艺路线，树脂残留溶剂可能有正己烷、苯、甲苯、乙苯、对二甲苯、间二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯。参考ICH Q3C[11]及《中华人民共和国药典》2020年版三七总皂苷（供注射用）标准限度[12]，各溶剂的类别及限度见表5。

表5 溶剂分类及限度

《中华人民共和国药典》2020年版三七总皂苷（供注射用）中各溶剂的限度更严。丹酚酸A为中药注射剂的原料，故丹酚酸A树脂残留的标准参考三七总皂苷的限度。乙苯在ICH及《中华人民共和国药典》中暂无溶剂分类及限度要求，参考甲苯的限度拟定为不得超过0.002%。树脂残留列入质量标准。

3.2 耐用性考察

考察了流速（1.4、1.5、1.6 mL/min）、柱温（53、55、57℃）、顶空平衡时间（28、30、32 min）、顶空平衡温度（83、85、87℃）、不同色谱柱（HP-INNOWAX、USP320142H）对检测结果的影响，树脂残留量的RSD均小于10%，方法耐用性良好。

本试验建立了一种测定丹酚酸A原料中树脂残留的方法，经验证均符合方法学要求。根据注射剂的安全性风险控制，并结合样品的实测结果，明确了树脂残留的控制要求，完善了本品质量标准，为其他中药新药原料药的树脂残留控制提供了参考。

表4 准确度试验（n=9)

参考文献:

[1]王梦姣,张兵.丹酚酸A治疗缺血性脑卒中的研究进展[J].现代医学, 2018, 46(6):724-727.

[3]艾文伟,张明,熊力,等.丹酚酸A通过lncRNA B调控TGF-β/Smads通路改善阿霉素诱导的心力衰竭的机制研究[J].实用中西医结合临床, 2022, 22(13):1-5, 10.

[4]张森,刘成娣,孔德文,等.丹酚酸A对氧糖剥夺诱导损伤的人脑微血管内皮细胞血管新生能力的保护作用及机制[J].中国药理学与毒理学杂志, 2022, 36(3):161-169.

[5]许雯珊,江萍利,刘雨露,等.丹酚酸A对缺血性脑卒中模型大鼠海马区蛋白影响的串联质谱标签蛋白组学分析[J].中国组织工程研究, 2022, 26(23):3714-3720.

[6]刘地发,王振,周鹏,等.动态轴向压缩色谱高效制备丹酚酸A工艺研究[J].江西中医药, 2022, 53(6):54-58.