阿尔茨海默病（Alzheimer disease,AD）是一种以进行性认知功能障碍和行为损害为特征的神经系统退行性疾病[1]。线粒体功能障碍是AD早期病理改变之一[2]。研究表明，AD患者除典型的认知功能障碍外，还存在运动功能障碍，表现为肌力和耐力降低、运动平衡和协调能力受损、步速步态变化及帕金森样症状等[3,4,5,6,7,8]。线粒体是细胞能量代谢的中心，主要作用为氧化磷酸化产生三磷酸腺苷（ATP),ATP是生命活动的直接能量来源。线粒体持续分裂和融合的动态变化过程称为线粒体动力学[9]，线粒体动力学不仅决定线粒体的形态和数目，还调控线粒体分布与功能，在维持细胞生理功能方面发挥重要作用[10]。骨骼肌是富含线粒体的高能耗组织，线粒体动力学失衡会引起线粒体形态结构及功能异常，最终导致骨骼肌萎缩、运动功能障碍等[11,12,13]。视神经萎缩症蛋白1(OPA1）、线粒体融合蛋白（MFN)1和MFN2分别调节线粒体内膜和外膜的融合[14],MFN2在骨骼肌和大脑中呈高表达[15,16]。线粒体动力学相关蛋白1(DRP1）是调节线粒体分裂的重要蛋白[17]。课题组前期研究研究显示，益肾调督针法能改善快速老化模型（SAMP8）小鼠的学习记忆能力[18,19,20]，本研究在前期基础上，进一步观察该针法对SAMP8小鼠运动功能的影响，为治疗AD运动功能障碍提供实验依据。

1、实验材料

1.1 动物

SPF级8月龄雄性SAMP8小鼠18只、同月龄抗快速老化（SAMR1）小鼠9只，体质量（35±5)g，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，动物生产许可证号SCXK（京）2019-0008。饲养于福建中医药大学SPF级动物实验中心，温度22～24℃，湿度50%～60%,12 h光照，自由摄食饮水，动物使用许可证号SYXK（闽）2019-0002。本实验经福建中医药大学动物伦理委员会审批（2021100），实验过程严格按照国家动物保护法和实验动物伦理要求进行。

1.2 主要试剂与仪器

GAPDH抗体（货号5174S）、OPA1兔单克隆抗体（货号80471S）、MFN2兔单克隆抗体（货号9482S），美国Cell Signaling Technology;DRP1兔单克隆抗体（货号ab184247），英国Abcam;ATP含量测定试剂盒（货号A095-1-1），南京建成；超敏ECL化学发光试剂盒（货号MAO186-1），上海碧云天生物；反转录试剂盒（货号R123-01）、荧光定量试剂盒（货号Q311-02），南京诺唯赞。

0.25 mm×13 mm华佗牌无菌针灸针（苏州医疗用品厂有限公司），G6805-Ⅰ电针仪（青岛鑫升实业有限公司），Power Pac Basic电泳仪、CFX 96 Touch实时荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad公司），Eclipse 55i生物显微镜（日本Nikon公司），Morris水迷宫测试系统（上海欣软信息科技有限公司），ZL-010大小鼠抓力仪（安徽耀坤生物科技有限公司）。

2、实验方法

2.1 分组及干预

18只SAMP8小鼠按随机数字表法分为模型组和电针组，每组9只，另9只SAMR1小鼠作为对照组。将小鼠固定在自制固定器上，根据《实验针灸学（第2版）》[21]选取“百会”（顶骨正中）、“大椎”（第7颈椎与第1胸椎间）和双侧“肾俞”（第2腰椎棘突下旁开5 mm），“百会”向前斜刺2 mm，“大椎”向下斜刺2～3 mm，“肾俞”向脊柱斜刺3～4 mm，“大椎”“肾俞”（两侧隔日交替）连接电针仪，连续波，频率2 Hz，电流强度1.5～2 m A,20 min/次，1次/d,8 d为1个疗程，间隔2 d，连续3个疗程。模型组与对照组以同样方式抓取固定，但不进行干预。

2.2 运动功能检测

2.2.1 抓力测试

干预结束后进行抓力测试，正式测试前3 d让小鼠每日固定时间练习抓杆1次。测试时，抓住小鼠尾巴，将其前肢轻放在抓力板前端固定位置（避免后肢碰到抓力板），待其前肢抓紧时，尽可能使小鼠身体与抓力板平行后，用均匀的力水平将其尾巴向后拉动直至小鼠前爪松开，同时记录显示屏上数值（gf/g），重复测量5次，取平均值作为最终结果。

2.2.2 悬挂实验

将小鼠前肢置于距地面30 cm的水平金属丝上，当其后肢抓稳金属丝后松手，观察小鼠抓握情况并进行评分[22]：双侧后肢均抓住金属丝为3分，仅有一侧后肢抓住金属丝为2分，双侧后肢均不能抓住金属丝为1分，小鼠掉落为0分。每只小鼠重复测量3次，取平均值。

2.2.3 后肢伸展实验

提起小鼠尾巴，观察后肢伸展情况并进行评分[23]：后肢远离躯体呈“V”字形展开为4分，表示没有肌张力障碍；后肢无法完全远离躯体或伴有后肢颤抖为3分，表示轻微肌张力障碍；后肢紧贴躯体但可以活动为2分，表示中度肌张力障碍；后肢紧贴躯干且无法活动为1分，表示严重肌张力障碍。重复测量3次，取平均值。

2.2.4 Morris水迷宫实验

采用Morris水迷宫系统，将逃生平台放在第三象限，水面高出逃生平台1 cm，将小鼠从第一象限中点面向池壁放入水中，自动跟踪探测仪采集记录小鼠在90 s内的平均速度和最大速度。

2.3 HE染色

运动功能检测结束后，每组取3只小鼠，用0.3%戊巴比妥钠（0.2 m L/10 g）腹腔注射麻醉，取腓肠肌组织。将左侧腓肠肌组织置于4%多聚甲醛中固定48 h，经脱水、透明、浸蜡、包埋后，连续切片（厚度5μm），经脱蜡、水化和染色后，光学显微镜下观察腓肠肌形态。

2.4 比色法检测

取“2.3”项下右侧腓肠肌组织，加入9倍体积冷双蒸水，制成10%匀浆，置于沸水浴中煮10 min,14 000 r/min离心10 min，取上清液，按试剂盒说明书操作，酶标仪波长636 nm测定各管吸光度（OD值），计算ATP含量（μmol/g）。

2.5 实时荧光定量PCR检测

行为学检测结束后，每组取6只小鼠，0.3%戊巴比妥钠（0.2 m L/10 g）腹腔注射麻醉，取左侧腓肠肌组织，加入Trizol 1 m L充分研磨，冰上静置10 min,4℃、14 000 r/min离心5 min，取上清液，加入200μL氯仿，振荡20 s，冰上静置10 min,4℃、14 000 r/min离心5 min，吸取上清液至新EP管中，加入等体积预冷异丙醇，摇匀后冰上静置10 min，离心，沉淀加1 m L75%乙醇洗涤，室温静置5 min，离心，沉淀加适量DEPC水溶解，测定RNA浓度。冰上配制反应混合液，42℃反应2 min，加入5×HiscriptⅡq RT Super MixⅡ，50℃反应15 min,85℃反应2 min。配制PCR反应液，反应条件：95℃预变性30 s;95℃、10 s,60℃、30 s，共40个循环；95℃、15 s,60℃、60 s,95℃、15 s。以GAPDH为内参，2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。引物序列见表1。

表1 各基因PCR引物序列 

2.6 Western blot检测

取“2.5”项下右侧腓肠肌组织，加入RIPA裂解液（组织质量∶裂解液∶PMSF=10 mg∶100μL∶1μL），充分研磨后，冰上静置30 min,4℃、14 000 r/min离心10 min，取上清液，BCA法进行蛋白定量。蛋白上样、电泳、转膜、封闭后，加入OPA1、MFN2、DRP1一抗（1∶1 000）和GAPDH一抗（1∶5 000),4℃摇床孵育过夜，TBST洗膜7 min×4次，加二抗（1∶10 000），室温摇床孵育1 h,TBST洗膜7 min×4次，ECL显影液显影。Image lab软件分析条带，计算目的蛋白和内参（GAPDH）灰度值及蛋白相对表达量。

3、统计学方法

使用SPSS23.0统计软件进行分析。计量资料以表示，组间比较用方差分析，方差齐用LSD法，方差不齐用Games Howell法。P<0.05表示差异有统计学意义。

4、结果

4.1 电针对模型小鼠运动功能的影响

与对照组比较，模型组小鼠抓力、悬挂实验评分及Morris水迷宫实验平均速度和最大速度显著降低（P<0.01）；与模型组比较，电针组小鼠抓力、悬挂实验评分及Morris水迷宫实验平均速度和最大速度显著升高（P<0.01）。各组小鼠后肢伸展实验评分差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

表2 各组小鼠运动功能比较  

4.2 电针对模型小鼠腓肠肌组织形的影响

对照组小鼠腓肠肌纤维排列整齐，胞质染色整体一致，细胞核分布均匀；与对照组比较，模型组小鼠腓肠肌纤维排列混乱且连续性差、间隙变宽，胞质染色深浅不一，细胞核分布不均匀；与模型组比较，电针组小鼠腓肠肌排列较整齐、间隙变窄，胞质染色较一致，细胞核分布较均匀。见图1。

图1 各组小鼠腓肠肌组织形态（HE染色）   

4.3 电针对模型小鼠腓肠肌组织三磷酸腺苷含量的影响

与对照组比较，模型组小鼠腓肠肌组织ATP含量显著降低（P<0.01）；与模型组比较，电针组小鼠腓肠肌组织ATP含量显著升高（P<0.01）。见表3。  

表3 各组小鼠腓肠肌组织ATP含量比较  

4.4 电针对模型小鼠腓肠肌组织线粒体动力学相关指标m RNA表达的影响

与对照组比较，模型组小鼠腓肠肌组织OPA1、MFN2 m RNA表达显著降低，DRP1 m RNA表达显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，电针组小鼠腓肠肌组织OPA1、MFN2 m RNA表达显著升高，DRP1 m RNA表达显著降低（P<0.01）。见表4。  

表4 各组小鼠腓肠肌组织OPA1、MFN2、DRP1 m RNA表达比较 

4.5 电针对SAMP8小鼠腓肠肌组织线粒体动力学相关指标蛋白表达的影响

与对照组比较，模型组小鼠腓肠肌组织OPA1、MFN2蛋白表达显著降低，DRP1蛋白表达显著升高（P<0.01）；与模型组比较，电针组小鼠腓肠肌组织OPA1、MFN2蛋白表达显著升高，DRP1蛋白表达显著降低（P<0.05,P<0.01）。见图2、表5。

图2各组小鼠腓肠肌组织OPA1、MFN2、DRP1蛋白免疫印迹     

表5 各组小鼠腓肠肌组织OPA1、MFN2、DRP1蛋白表达比较 

5、讨论

AD病位在脑，属本虚标实之证，本虚以肾虚为主[24]，又因督脉通于脑-肾，故以益肾调督法为指导，选取督脉百会、大椎及汇集肾中精气的肾俞作为治疗腧穴。研究表明，益肾调督针法对认知功能[25,26]和运动功能[27,28,29]均有改善。本研究行为学检测结果也显示，益肾调督针法对运动功能有改善作用。

SAMP8小鼠脑组织内有大量β淀粉样蛋白（Aβ）沉积，与AD病理变化相似，是研究AD的较成熟模型。相关研究报道，SAMP8小鼠在8月龄左右会出现骨骼肌质量、力量和功能下降表现[30,31,32]。本研究行为学检测结果显示，模型组小鼠存在肌肉力量下降和运动功能障碍，与前期研究结果[31,32]一致，电针组小鼠肌肉力量与运动功能障碍明显改善。研究发现，Aβ会诱导MFN1/2低表达，促进线粒体分裂相关蛋白表达，引起神经元线粒体凋亡，导致AD发生[33]。AD模型小鼠大脑皮层DRP1表达升高、MFN2表达降低[34],AD模型大鼠海马神经元线粒体分裂蛋白1(Fis1）表达升高，OPA1表达降低，益肾调督针法可下调Fis1表达、上调OPA1表达，改善线粒体动力学异常，起到治疗AD作用[35]。因此，本研究进一步观察AD模型小鼠骨骼肌线粒体动力学变化。

骨骼肌是富含线粒体的高能耗组织，线粒体动力学平衡能保证骨骼肌能量代谢充足，从而维持骨骼肌功能正常[36]。本研究中，模型组小鼠腓肠肌组织ATP含量显著减少，OPA1和MFN2表达显著降低，DRP1表达显著升高，提示AD模型骨骼肌存在线粒体动力学失衡。HE染色和行为学检测结果表明，模型组小鼠腓肠肌结构异常，并存在肌力下降和运动功能障碍。后肢伸展实验结果显示，模型小鼠肌张力未见明显变化，与既往研究结果[23]一致，提示肌张力障碍可能出现于疾病中晚期。经电针治疗后，电针组小鼠腓肠肌组织ATP含量显著增加，OPA1和MFN2表达显著升高、DRP1表达显著降低，腓肠肌病理形态、肌力和运动功能得到改善，提示电针能改善骨骼肌线粒体动力学失衡状态，提高骨骼肌ATP含量，改善骨骼肌形态结构和运动功能障碍。

综上所述，电针可改善SAMP8小鼠骨骼肌形态结构和运动功能障碍，其机制可能与调节骨骼肌线粒体动力学失衡状态，提高骨骼肌ATP含量有关。

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基金资助:国家自然科学基金(81973923);福建省自然科学基金(2022J01348);福建省中医药科研项目(2021zyjc23);

文章来源:温若兰,郭婉清,董卫国等.电针对快速老化模型小鼠骨骼肌线粒体动力学的影响[J].中国中医药信息杂志,2024,31(02):104-109.