阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一种神经退行性疾病，随着人口老龄化的发展，AD患病率持续增长[1],认知功能障碍和行为学改变是AD的主要临床表现[2]。AD的典型特征是2种标志性病理：β-淀粉样蛋白(Beta-amyloid protein, Aβ)斑块沉积和过度磷酸化tau的神经原纤维缠结[3]。此外，AD的进展也涉及脑内核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)介导的过度神经炎症。田蓟苷(tilianin)是香青兰(Dracocephalum moldevica L.)中的主要黄酮类化合物[4]。本研究旨在探讨田蓟苷联合有氧训练对AD大鼠认知功能的影响，及其作用机制。

一、材料与方法

1 材料

动物SPF级SD大鼠，雄性，鼠龄7～8周，体质量280～320 g, 广东至远生物医药科技有限公司提供。动物生产许可证号：SCXK(粤)2023-0066。本实验经郑州大学体育学院生物医学研究伦理委员会批准[伦理批号：伦审科2023第(00596)号]。

药品与试剂田蓟苷，规格：每瓶100 mg, 纯度：99.57%,批号：HY-N2555-84235,美国Med Chem Express公司生产。大鼠β-淀粉样蛋白1-42(Aβ1-42)多肽，大连美仑生物技术有限公司生产；尼氏染色液，碧云天生物技术研究所生产；二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)、羧甲基纤维素钠(sodium carboxymethyl cellulose, CMC)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)ELISA试剂盒、IL-6 ELISA试剂盒，均为北京索莱宝科技有限公司生产；PrimerScript RT试剂盒、SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂盒，均为日本TaKaRa公司生产；β-淀粉样前体蛋白裂解酶1(β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1,BACE1)一抗、NF-κB p65一抗、p-NF-κB p65一抗、β-actin一抗、HRP结合的免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)二抗，均为美国Abcam公司生产；Aβ1-42一抗，美国Cell Signaling Technology公司生产。

仪器BHV-M1Morris水迷宫系统，北京必海微公司产品；ZH-PT/5S动物实验跑台，安徽正华公司产品；Bio-Rad iQ5 PCR仪，美国Bio-Rad公司产品。

2 实验方法

2.1 模型构建[5]5]

通过对大鼠双侧海马注射Aβ1-42建立AD大鼠模型。Aβ1-42溶解在50% DMSO中，用0.9%NaCl稀释至2 μg·μL-1,37 ℃孵育7 d。麻醉大鼠后，固定在脑立体定位仪上，颅顶中线做1 cm切口，定位双侧海马，牙钻钻开颅骨，暴露硬脑膜，用5 μL微量注射器针头向双侧海马注入Aβ1-42溶液5 μL。假手术大鼠注射0.9%NaCl 5 μL。缝合伤口，消毒，回笼饲养。

2.2 动物分组与给药方法

建模后，将大鼠分为7组：空白组、模型组、对照组、低剂量实验组、中剂量实验组、高剂量实验组和联合组，每组12只。空白组为进行假手术的大鼠，其他组为AD模型大鼠。建模1周后，对照组和联合组大鼠进行跑台有氧训练，其他组大鼠安静饲养。运动方案[6]如下：第1周前3 d速度为5 m·min-1,第4和5天为10和15 m·min-1,时长为30 min。第2周之后速度恒定15 m·min-1,时间为1 h。每周训练5 d, 共6周。建模1周后，空白组、模型组、对照组均灌胃给予0.5%CMC 2 mL。低、中、高剂量实验组大鼠灌胃给予5、10和20 mg·kg-1·d-1的田蓟苷[7](溶于0.5%CMC)2 mL。联合组灌胃给予20 mg·kg-1·d-1的田蓟苷2 mL,2 h后进行跑台有氧训练。7组大鼠均给药6周。

2.3 Morris水迷宫实验评估认知功能[8]8]

有氧训练和田蓟苷给药结束后，进行Morris水迷宫实验。在测试过程中将平台随机放置在Morris水迷宫(直径150 cm, 高度60 cm)某一象限内。定位航行实验：将大鼠选择一个象限放入水中，记录登陆平台(直径12 cm)的时间，取平均值作为逃避潜伏期。每天训练4次，共训练6 d。空间探索实验：移除平台，在第四象限放入大鼠，记录60 s内穿越平台的次数。

2.4 尼氏染色观察海马神经元损伤[9]9]

将海马冰冻切片用4%多聚甲醛固定10 min, 蒸馏水洗涤，尼氏染色液染色5 min, 用蒸馏水将染色液冲洗干净，然后对切片进行常规脱水、透明、封片、镜检。

2.5 ELISA法检测海马炎症因子[10]10]

将海马组织剪碎，匀浆，离心取上清液，通过ELISA法检测海马TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

2.6 qRT-PCR法检测海马组织中BACE1 mRNA的表达水平[11]11]

用Trizol从海马区提取总RNA。用PrimerScript RT进行逆转录。用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒在Bio-Rad iQ5 PCR仪上进行PCR。以β-actin作为内源性参考基因。用2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。

2.7 蛋白质印迹法检测海马BACE1、Aβ1-42、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白的表达水平[12]12]

用放射免疫沉淀裂解液裂解海马组织，用二喹啉甲酸法测量海马蛋白质浓度，样品经12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳层析分离，转移到聚偏二氟乙烯膜上。5%脱脂牛奶封闭1 h, 然后将膜与1∶1 000稀释的BACE1、Aβ1-42、NF-κB p65、p-NF-κB p65和β-actin一抗4 ℃过夜孵育，然后将膜与1∶1 000稀释的HRP结合的IgG二抗37 ℃孵育1 h, ECL显影。以β-actin作为内源性参考蛋白，用Image J软件分析条带灰度值。

3 统计学处理

用SPSS 22.0软件进行统计分析。数据用

表示，用单因素方差分析和LSD t检验比较组间差异。

二、结果

1 田蓟苷联合有氧训练对AD大鼠认知功能的影响

空白组、模型组、对照组灌胃给予0.5%CMC 2 mL;低、中、高剂量实验组大鼠分别灌胃给予5、10和20 mg·kg-1·d-1的田蓟苷2 mL;联合组灌胃给予20 mg·kg-1·d-1的田蓟苷2 mL,2 h后进行跑台有氧训练。

空白组、模型组、对照组、低剂量实验组、中剂量实验组、高剂量实验组和联合组的逃避潜伏期分别为(20.16±2.06)、(60.45±6.55)、(46.52±2.90)、(42.80±3.15)、(41.19±2.54)、(35.66±2.82)和(28.49±1.97) s, 60 s内穿越平台的次数分别为(11.66±1.05)、(4.12±0.32)、(6.84±0.60)、(6.99±0.30)、(8.02±0.39)、(8.73±0.72)和(9.71±0.86)次。与空白组比较，模型组的逃避潜伏期显著升高，60 s内穿越平台的次数显著降低(均P<0.05);与模型组比较，对照组、联合组和低、中、高剂量实验组的逃避潜伏期均显著降低，60 s内穿越平台的次数均显著升高(均P<0.05)。联合组的逃避潜伏期均较对照组和高剂量实验组显著降低，60 s内穿越平台的次数均较对照组和高剂量实验组显著升高(均P<0.05)。

2 田蓟苷联合有氧训练对AD大鼠神经元形态的影响

尼氏染色结果显示：空白组大鼠尼氏体染色均一，神经元形态正常；与空白组比较，模型组出现神经元变形，核皱缩、深染；与模型组比较，对照组、低剂量实验组、中剂量实验组、高剂量实验组、联合组的神经元形态明显改善，其中联合组的神经元形态基本恢复正常。结果见图1。

3 田蓟苷联合有氧训练对AD大鼠海马组织BACE1和Aβ1-42表达的影响

空白组、模型组、对照组、低剂量实验组、中剂量实验组、高剂量实验组和联合组的BACE1 mRNA相对表达量分别为1.00±0.06、7.88±0.49、6.02±0.38、4.96±0.57、3.01±0.21、1.98±0.17和1.48±0.11,BACE1蛋白相对表达水平分别为0.09±0.02、1.19±0.10、0.89±0.08、0.61±0.06、0.39±0.04、0.32±0.02和0.17±0.01,Aβ1-42蛋白相对表达水平分别为0.10±0.01、1.25±0.07、0.88±0.09、0.67±0.06、0.41±0.05、0.23±0.02和0.15±0.01。模型组的BACE1 mRNA、BACE1蛋白和Aβ1-42蛋白表达水平均较空白组显著升高(均P<0.05);对照组、低剂量实验组、中剂量实验组、高剂量实验组、联合组的BACE1 mRNA、BACE1蛋白和Aβ1-42蛋白表达水平均较模型组显著降低(均P<0.05)。联合组的BACE1 mRNA、BACE1蛋白和Aβ1-42蛋白表达水平均较对照组和高剂量实验组降低(均P<0.05)。结果见图2。

4 田蓟苷联合有氧训练对AD大鼠海马组织炎症因子水平的影响

模型组的TNF-α、IL-1β和IL-6水平均较空白组显著升高(均P<0.05);对照组、低剂量实验组、中剂量实验组、高剂量实验组、联合组的海马组织TNF-α、IL-1β和IL-6水平均较模型组显著降低(均P<0.05);联合组的海马组织TNF-α、IL-1β和IL-6水平均较对照组和高剂量实验组显著降低(均P<0.05),见表1。

图1 在倒置显微镜下各组大鼠的海马尼氏染色(×400)

图2 各组大鼠海马组织中β-淀粉样前体蛋白裂解酶1(BACE1)和β-淀粉样蛋白1-42(Aβ1-42)蛋白的表达情况

表1 各组大鼠海马组织炎症因子水平的比较

5 田蓟苷联合有氧训练对AD大鼠海马组织NF-κB活化的影响

空白组、模型组、对照组、低剂量实验组、中剂量实验组、高剂量实验组、联合组的p-NF-κB p65/NF-κB p65水平分别为0.11±0.03、1.46±0.11、0.89±0.10、0.71±0.06、0.37±0.05、0.29±0.02和0.15±0.01,模型组的p-NF-κB p65/NF-κB p65水平较空白组显著升高(P<0.05),对照组、低剂量实验组、中剂量实验组、高剂量实验组、联合组的p-NF-κB p65/NF-κB p65水平均较模型组显著降低(均P<0.05),联合组的p-NF-κB p65/NF-κB p65水平均较对照组和高剂量实验组显著降低(均P<0.05)。

三、讨论

BACE1是唯一的β分泌酶，可促进Aβ的产生和积累[13]。AD患者脑组织和体液中BACE1活性增加，抑制BACE1的活性，减缓Aβ产生是治疗AD的主要靶点[13]。本研究结果表明，田蓟苷和有氧训练均抑制AD大鼠海马BACE1和Aβ1-42的表达，二者联合的效果最佳。这些结果说明田蓟苷联合有氧训练可能通过抑制BACE1和Aβ1-42的表达，从而发挥抗AD作用。

Aβ可激活小胶质细胞释放促炎因子如TNF-α、IL-1β和IL-6,引起神经炎症，影响AD患者的神经元存活和认知功能[14]。NF-κB是调节炎症级联反应的重要转录因子，在AD进展中，激活的NF-κB移位到细胞核中增加促炎基因转录，放大炎症级联反应，从而损伤认知功能[15]。本研究结果表明，田蓟苷和有氧训练均抑制了AD大鼠海马组织TNF-α、IL-1β和IL-6的表达，抑制了NF-κB的磷酸化，从而降低了Aβ1-42诱导的神经炎症，二者联合效果最佳。田蓟苷发挥的神经保护作用涉及增加神经元活力、抑制细胞凋亡和抑制炎症，这依赖于恢复海马中p-CaMKⅡ/ERK1/2/CREB信号通路和抑制ox-CaMKⅡ/p38MAPK/JNK/NF-κB信号通路[7]。这些结果说明田蓟苷联合有氧训练可能通过抑制NF-κB信号通路介导的炎症反应，从而发挥抗AD作用。

本研究提示，田蓟苷联合有氧训练能显著改善AD大鼠的认知功能，其机制可能与抑制NF-κB信号通路介导的炎症反应有关。

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基金资助:河南省科技厅科技发展基金资助项目(202102310324);

文章来源:黄波,吴卫东,王峥,等.田蓟苷联合有氧训练对阿尔茨海默病大鼠认知功能的影响[J].中国临床药理学杂志,2024,40(11):1618-1622.