急性心肌梗死（acute myocardial infarction,AMI）是一种常见的心血管系统疾病[1]。川芎嗪（tetramethylpyrazine,TMP）是一种从传统中药川芎中分离出的酰胺类生物碱，具有活血化瘀等功效[2]。研究表明，TMP可通过抑制心肌细胞凋亡等途径改善AMI损伤[3]。miRNAs是一类短而高度保守的非编码RNA，在心脏疾病的预后中起着重要作用。研究表明，miR-155-5p可能作为潜在治疗靶点在心肌损伤中发挥作用[4]。本研究通过体内外实验探究miR-155-5p是否为TMP治疗AMI的分子靶点。

一、材料与方法

1材料

动物SPF级SD雄性大鼠，鼠龄5～6周，体质量为220～260 g，购自华中科技大学动物实验中心。动物生产许可证号：SCXK（鄂）2021-0009。本实验经武汉市第三医院动物伦理委员会批准（伦理批号：武三医实伦2023099）。

细胞大鼠心肌细胞H9C2、人胚肾细胞293T均，购自美国ATCC公司。

药品与试剂川芎嗪，纯度：98%，规格：每瓶20 mg，批号：20230512，购自上海源叶生物公司。LipofectamineTM3000转染试剂，购自上海同里生物公司；肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α）、白细胞介素-1β(interleukin1β,IL-1β）酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）试剂盒，均购自上海户实医药公司；肌酸激酶同工酶（creatine kinase MB,CK-MB) ELISA试剂盒，购自上海白益生物科技有限公司；原位末端标记法（terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling,Tunel）试剂盒，购自上海碧云天生物公司；心肌肌钙蛋白Ⅰ（cardiac troponinⅠ，cTnⅠ）一抗、B淋巴细胞瘤-2 (B-cell lymphoma-2,Bcl-2）一抗、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein,Bax）一抗，均购自英国Abcam公司。所有引物，均由上海碧云天生物公司合成。

仪器ULTIMUS 9 LAB型小动物超分辨超声成像系统，飞依诺公司产品；UMC 800TFL生物荧光显微镜，广州科适特科学仪器公司产品；SLAN-96S型实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）仪，上海宏石医疗公司产品。

2实验方法

2.1动物实验

2.1.1模型构建、动物分组与处理方法[5]

将大鼠麻醉后固定，插管，在大鼠胸骨旁左侧作切口分离肌肉暴露心脏，用缝合线结扎左冠状动脉前降支，心电图显示，ST段弓背上抬（>0.1 mV）并伴随心肌发绀表示结扎成功，随后用缝合线进行缝合，放回饲养笼。

随机选取10只大鼠作为假手术组，假手术组大鼠只穿线不结扎。剩余的大鼠造模后随机分为AMI组、AMI+TMP组、AMI+TMP+miR-155-5p组、AMI+TMP+miR-155-5p+ACTA1组，每组10只大鼠。AMI组建立AMI模型；AMI+TMP组大鼠建模后24 h腹腔注射20 mg·kg-1的TMP;AMI+TMP+miR-155-5p组大鼠建模后腹腔注射20 mg·kg-1的TMP及尾静脉注射miR-155-5p过表达质粒200μL;AMI+TMP+miR-155-5p+ACTA1组大鼠建模后腹腔注射20 mg·kg-1的TMP及尾静脉注射miR-155-5p、骨骼肌肌动蛋白A1 (skeletal muscle actin A1,ACTA1）过表达质粒200μL，每天1次，连续给药2周后检测大鼠心功能，心尖采血后处死大鼠取心肌组织进行后续实验。

2.1.2心脏超声检测大鼠心功能左心室舒张末期内径（left ventricular end-diastolic dimension,LVEDD）和左心室射血分数（left ventricular ejection fraction,LVEF)[5]

药物处理结束后禁食12 h，用超声心动仪进行心脏超声检测，记录LVEDD及LVEF值，检测3次取平均值。

2.1.3免疫组化法检测心肌组织中cTnⅠ的表达水平[6]

心肌组织石蜡切片常规脱蜡和水化，用3%的内源性H2O2孵育10 min，加入cTnⅠ一抗（1∶500)4℃孵育，次日加入二抗再反应10 min，用二氨基联苯胺染色1 min，然后用苏木精反染后脱水、封片使用显微镜观察。

2.1.4 ELISA法检测大鼠血清CK-MB、TNF-α、IL-1β水平[7]

取各组大鼠血清，以3 500 r·min-1离心15 min后收集上清液，根据试剂盒法用酶标仪进行检测。

2.1.5 Tunel实验检测大鼠心肌细胞凋亡率[8]

取心肌组织切片，用Triton-X100 (3%）室温下封闭1 h,3%过氧化氢阻断处理10 min，蛋白酶K室温消化10 min，滴加Tunel结合液（37℃，1 h),DAPI试剂进行核染10 min，封片后，在荧光显微镜下观察。

2.1.6实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative re-verse-transcriptionpolymerase chain reaction,qRT-PCR）法检测大鼠心肌组织中miR-155-5p、ACTA1、TNF-α、IL-1β mRNA的表达水平[6]

用TRIzol试剂提取大鼠心肌组织，用试剂盒将RNA合成cDNA，然后进行荧光定量PCR扩增，共35个循环，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）为内参，用2-ΔΔCt法计算表达量。

2.1.7蛋白质印迹法检测大鼠心肌组织中Bax、Bcl-2蛋白的表达水平[5]

心肌组织加入裂解液裂解后提取总蛋白，定量后进行凝胶电泳分离蛋白转至聚偏二氟乙烯膜，封闭1 h，滴加一抗试剂孵育（4℃），次日滴加二抗孵育45 min(37℃，摇床），进行显影、充分曝光后进行灰度值分析。

2.2细胞实验

2.2.1细胞分组与处理方法[9]

将H9C2细胞随机分为对照组（NC组）、LPS、LPS+TMP、LPS+TMP+miR-155-5p、LPS+TMP+miR-155-5p+ACTA1组。NC组细胞为正常培养；LPS+TMP组细胞用1μg·mL-1的LPS和146.85μmol·L-1的TMP共同处理细胞24 h;LPS+TMP+miR-155-5p组细胞先用LipofectamineTM3000转染试剂将miR-155-5p质粒转染至细胞，48 h后，再用1μg·mL-1的LPS和146.85μmol·L-1的TMP共同处理细胞24 h;LPS+TMP+miR-155-5p+AC-TA1组细胞先用转染试剂将miR-155-5p、ACTA1质粒转染至细胞48 h后再用1μg·mL-1的LPS和146.85μmol·L-1的TMP共同处理细胞24 h。

2.2.2 RT-qPCR法检测293T细胞中miR-155-5p转染效率[6]

将miR-155-5p mimic和miR-155-5p inhibitor质粒转染至293T细胞，参考“2.1.6”方法进行检测。

2.2.3 Tunel实验检测H9C2细胞的凋亡情况[8]

调整细胞密度（5×104cell·mL-1）并接种于24孔板，多聚甲醛（4%）固定30 min，用1%Triton-X-100试剂透化5 min，过氧化氢试剂（3%）封闭10 min，加入Tunel反应液染色1 h后，用DAPI复染，结束后封片镜检。

2.2.4蛋白质印迹实验检测心肌细胞中Bax、Bcl-2蛋白的表达水平[5]

取各组H9C2细胞，加入裂解液裂解后离心提取上清液收集总蛋然后根据“2.1.7”中步骤进行检测。

2.2.5 ELISA实验检测心肌细胞中TNF-α和IL-1β水平[7]

取各组大鼠H9C2细胞，以3 500 r·min-1离心15 min后收集上清液，根据试剂盒法用酶标仪检测。

3统计学处理

用SPSS 23.0软件进行统计分析。实验数据以表示，组间比较用单因素方差分析，2组比较用LSD-t检验。

二、结果

1川芎嗪对AMI大鼠心功能及心肌损伤的影响

假手术组大鼠只穿线不结扎；AMI组结扎左冠状动脉前降支建立模型；AMI+TMP组大鼠建模后24 h腹腔注射20 mg·kg-1TMP;AMI+TMP+miR-155-5p组大鼠建模后腹腔注射20 mg·kg-1的TMP及尾静脉注射miR-155-5p过表达质粒200μL;AMI+TMP+miR-155-5p+ACTA1组大鼠建模后腹腔注射20 mg·kg-1的TMP及尾静脉注射miR-155-5p、ACTA1过表达质粒200μL。

AMI组与假手术组比较，AMI+TMP组与AMI组比较、AMI+TMP+miR-155-5p组与AMI+TMP组比较，AMI+TMP+miR-155-5p+ACTA1组与AMI+TMP+miR-155-5p组比较，LVEDD、cTnⅠ、CK-MB、LVEF水平，在统计学上差异均有统计学意义（均P<0.05），见表1。

2川芎嗪对AMI大鼠心肌细胞凋亡的影响

假手术组、AMI组、AMI+TMP组、AMI+TMP+miR-155-5p组、AMI+TMP+miR-155-5p+ACTA1组的心肌细胞凋亡率分别为（2.90±0.66）%、（21.73±4.33）%、（14.32±2.57）%、（20.74±3.96）%和（15.34±2.66)%;AMI组与假手术组比较，AMI+TMP与AMI组比较、AMI+TMP+miR-155-5p组与AMI+TMP组比较，AMI+TMP+miR-155-5p+ACTA1组与AMI+TMP+miR-155-5p组比较，在统计学上差异均有统计学意义（均P<0.05）。

3川芎嗪对AMI大鼠miR-155-5p、ACTA1、TNF-α、IL-1β mRNA和Bax、Bcl-2蛋白表达及血清中TNF-α、IL-1β水平的影响

AMI组与假手术组比较，AMI+TMP组与AMI组比较、AMI+TMP+miR-155-5p组与AMI+TMP组比较，AMI+TMP+miR-155-5p+ACTA1组与AMI+TMP+miR-155-5p组比较，miR-155-5p、TNF-α、IL-1β、ACTA1 mRNA和Bax、Bcl-2蛋白相对表达水平在统计学上差异均有统计学意义（均P<0.05）。结果见表2。

假手术组、AMI组、AMI+TMP组、AMI+TMP+miR-155-5p组和AMI+TMP+miR-155-5p+ACTA1组血清中TNF-α水平分别为（11.03±2.96）、（76.56±9.66）、（46.30±8.76）、（66.97±10.77）和（50.03±8.87) pg·mL-1,IL-1β水平分别为（17.76±3.96）、（57.63±11.03）、（27.03±7.36）、（51.04±8.33）和（29.22±8.03) pg·mL-1。AMI组的上述指标假手术组比较，AMI+TMP组的上述指标AMI组比较、AMI+TMP+miR-155-5p组的上述指标AMI+TMP组比较，AMI+TMP+miR-155-5p+ACTA1组的上述指标AMI+TMP+miR-155-5p组比较，在统计学上差异均有统计学意义（均P<0.05）。

表1 各组大鼠心功能相关指标的比较

表2 各组大鼠心肌组织miR-155-5p、骨骼肌肌动蛋白A1(ACTA1）、肿瘤坏死因子-α(TNF-α）、白细胞介素-1β(IL-1β)mRNA及B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）蛋白表达的比较 

表3 各组细胞凋亡率及Bax、Bcl-2、TNF-α、IL-1β水平的比较

4川芎嗪对H9C2细胞凋亡及炎性反应的影响

LPS组与NC组比较、LPS+TMP+miR-155-5p组与LPS+TMP组比较，细胞凋亡率、Bax蛋白相对表达水平及TNF-α、IL-1β水平均显著增加，Bcl-2蛋白相对表达水平均显著降低（均P<0.01);LPS+TMP组与LPS组比较、LPS+TMP+miR-155-5p+ACTA1组与LPS+TMP+miR-155-5p组比较，细胞凋亡率、Bax蛋白相对表达水平及TNF-α、IL-1β水平均显著降低，Bcl-2蛋白相对表达水平均显著升高（均P<0.01）。结果见表3。

三、讨论

本研究结果发现，经TMP治疗后，AMI大鼠的LVEDD及cTnⅠ、CK-MB水平均显著降低，LVEF值显著升高，研究表明cTnⅠ、CK-MB水平的升高与AMI的进展密切相关[10]。这提示TMP对AMI心肌损伤具有一定的保护作用。进一步研究发现，经TMP治疗后，AMI大鼠心肌组织miR-155-5p高表达，ACTA1表达下调。

本研究观察到TMP治疗后，AMI大鼠心肌组织炎性细胞浸润降低、心肌纤维化减轻，且体内外实验均发现AMP治疗后大鼠或H9C2细胞中促炎因子TNF-α、IL-1β及心肌细胞凋亡率、促凋亡蛋白Bax均显著降低，抑凋亡蛋白Bcl-2均明显上调，这提示TMP可通过抑制炎性反应、心肌细胞凋亡和纤维化改善AMI心肌损伤；而miR-155-5p和TMP联合治疗后，大鼠心肌纤维化较单独TMP治疗加重，且TNF-α、IL-1β炎性因子及心肌细胞凋亡率、Bax均显著增加，Bcl-2蛋白显著下调；进一步实验还发现上调ACTA1的表达联合miR-155-5p与TMP治疗后，AMI大鼠心肌纤维化、炎性反应、细胞凋亡率较miR-155-5p联合TMP治疗组均明显减轻，以上结果均提示TMP可能通过调控miR-155-5p靶向ACTA1抑制细胞凋亡，减轻炎症反应及心肌纤维化改善AMI心肌损伤。

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