猫杯状病毒NS2蛋白的截短表达及多克隆抗体的制备与应用生猫科动物[1]｡ 全基因组有3个开放阅读框( openreading frames, ORFs), ORF1 (20 ~ 5 311 nt)编码非结构蛋白,最终被病毒蛋白酶(3C样半胱氨酸蛋白酶)切割成7个非结构蛋白,包括非结构蛋白1(NS1)､ 非结构蛋白2 ( NS2)､ 膜 核 苷 三 磷 酸 酶(NS3 )､ 非 结 构 蛋 白4 ( NS4 )､ 非 结 构 蛋 白5(NS5)､ 非结构蛋白6 / 7 (NS6 / 7)[2-3]｡ORF1多蛋白在第一个ATG开始翻译,先形成了一个融合蛋白即NS1 / 2,该蛋白将在E46 / A47位点和E331 / D332位点被切割,形成NS2蛋白,分子质量为32 kDa,因此命名为p32,全长855 bp[4]｡NS2在FCV复制中的作用尚未确定,然而, NS2在病毒基因组中的位置表明其是一个小核糖核酸2B类似物[5]｡ 研究显示,在肠道病毒71型感染的情况下,病毒的非结构蛋白2B可以在转染后6 h增加细胞质Ca2+,同时诱导细胞凋亡,表明2B蛋白具有病毒孔蛋白 的 活 性[6]｡ 此 前 对 诺 如 病 毒 的NS2同 源 物(p48)的研究已经证明了高尔基分解的功能,而FCV NS2则没有这种功能[7]｡FCV RNA基因组复制所需要的成分都与膜相关,膜中包含成熟的ORF1编码的非结构蛋白,即NS2､NS3､NS4｡ 初步研究表明NS2是一种完整的膜蛋白,功能可能是形成复制复合体的 “核心”,锚定了许多其他成分｡ 在NS2的229 ~ 247 aa残基处包含疏水跨膜螺旋,帮助这三种非结构蛋白共定位于内质网,导致内质网膜的形态学改变[8-9]｡ 本研究对NS2蛋白质进行生物信息学分析,预测其抗原表位､ 结构域主要集中在6 ~ 86 aa｡ 由于全长蛋白无法表达,因此在110 aa处截短成2个基因片段,分别为NS2 -N和NS2-C,进行截短蛋白的原核表达和多克隆抗体的制备,为NS2蛋白的生物学功能研究提供生物学材料并奠定基础｡

1、材料与方法

1. 1主要材料

FCV (SH2014､FX5､GZ-VSD､F9)由本实验室分离并保存;猫肾细胞( CRFK)由本实验室保存; pET-32a (+)载体由本实验室保存;大肠杆菌DH5α､BL21 (DE3)感受态细胞均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司; 2月龄新西兰雌性大白兔购自上海杰思捷实验动物有限公司｡TRIzol RNA裂解液购自Invitrogen公司;反转录酶､ 高保真聚合酶､ 一步克隆连接酶､ 胶回收试剂盒均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司;质粒提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司; IPTG购自生工生物工程(上海)股份有限公司; His标签蛋白纯化试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司;弗氏完全佐剂､ 弗氏不完全佐剂购自默克生命科学有限公司; EMEM细胞培养液和胎牛血清购自Gibco公司; β-actin抗体(81115 - 1 -RR)购自Proteintech公司;碳酸纤维素膜(NC膜)购自宝生物工程(大连)有限公司｡

1. 2引物设计与合成根据

FCV-SH2014株NS2基因序列,设计扩增NS2基因和截短片段的特异性引物,引物包含pET-32a (+)质粒同源臂,引物序列见表1｡表1引物序列信息引物名称 引物序列(5′→3′)长度/ bpNS2-F gccatggctgatatcggatccATGGCGTGCCCGAGCTGCNS2-R tggtggtgctcgagtgcggccgcTTCGCTGCGAAAGCCGGT858NS2-N-F gccatggctgatatcggatccATGGCGTGCCCGAGCTGCNS2-N-R tggtggtgctcgagtgcggccgcGGTCTGATGCAGCGGAATGG330NS2-C-F gccatggctgatatcggatccCATCAGATGGCGCGCCTGNS2-C-R tggtggtgctcgagtgcggccgcTTCGCTGCGAAAGCCGGT528linker-NS2-N-F ggtggtggtggatctggtggtggtggatctATGGCGTGCCCGAGCTGCGCNS2-N-linker-R agatccaccaccaccagatccaccaccaccGGTCTGATGCAGCGGAATGG690注:序列中小写字母为同源臂,斜体字母linker为融合蛋白柔性连接体｡

1. 3目的基因扩增及重组

质粒构建将FCV接种于CRFK细胞,提取RNA,反转录获得cDNA,并以此为模板通过PCR扩增获得NS2基因｡pET-32a (+)载体在BamHⅠ和NotⅠ位点经双酶切,回收目的基因DNA片段和线性化载体,然后使用同源重组酶进行连接,连接产物转化大肠杆菌DH5α 感受态细胞并涂板, 37℃ 培养16 h后,挑取单菌落并进行菌液PCR,选取阳性菌落送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序,测序成功的菌液转接后提取重组质粒,进行双酶切鉴定,于-20℃保存备用｡

1. 4 NS2重组蛋白的诱导表达

将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞,挑取单菌落接种于1 mL氨苄抗性LB培养基, 8 h后将菌液按1∶100接种至新鲜400 mLLB培养基中, 37℃, 200 r/ min培养至OD600 nm值为0. 8,加入终浓度为1 mmol / L的IPTG, 37℃ 诱导表达15 h, 4℃, 10 000 r/ min离心15 min,弃去上清液,加入100 mL PBS重悬沉淀｡4℃, 10 000 r/ min离心15 min,收集沉淀并加入400 mL PBS重悬超声破碎, 4℃, 10 000 r/ min离心15 min,分别收集上清液和沉淀, SDS -PAGE分析蛋白表达形式｡ 根据试验结果,为了提高蛋白表达量,对IPTG的浓度､诱导时间､ 诱导温度和OD600 nm值进行优化｡ 用BCA蛋白定量试剂盒进行定量,纯化后的蛋白命名为FCV-NS2-N和FCV-NS2-N-N截短重组蛋白｡

1. 5多克隆抗体制备

对包涵体进行尿素梯度溶解和蛋白纯化试剂盒纯化,以纯化后的重组蛋白为抗原对2月龄新西兰雌性大白兔进行背部皮下免疫注射｡ 首次免疫,重组蛋白NS2-N与等比例的弗氏完全佐剂充分混合乳化,共计注射1 mg蛋白｡ 每间隔14 d进行第2､3和4次免疫,抗原为重组蛋白NS2-N-N,佐剂为弗氏不完全佐剂,方法､ 剂量与首次免疫相同｡ 第4次免疫后5d采集血液,分离血清,即为多克隆抗体,于-20℃保存备用｡

1. 6多克隆抗体的Western blot鉴定

用感染复数( MOI)为0. 5的FCV ( SH2014､FX5､GZ -VSD､F9)感染CRFK细胞,分别在6､12､18和24 h收样,进行SDS-PAGE分析,将蛋白质转印至NC膜｡ 转印结束进行5%脱脂乳(TBST稀释) 37℃封闭2 h; TBST洗涤3次, 10 min /次,以5%脱脂乳按1∶800稀释多克隆抗体并作为一抗, β-actin作为内参,按1∶50 000稀释,室温震荡孵育2 h, 45 r/ min;以HRP标记的山羊抗兔IgG (H+L)作为二抗,室温震荡孵育1 h, 45 r/ min; TBST洗涤后,利用ECL发光成像系统显色｡

1. 7间接免疫荧光试验

(IFA)鉴定病毒感染CRFK细胞, 16 h后用4%多聚甲醛室温固 定25 min, PBST洗3次, 5 min /次;加 入-20℃预冷的甲醇, - 20℃ 透化10 min, PBS洗3次, 6 min /次;用5%脱脂乳(PBS配制,加入0. 3%TrionX-100)封闭2 h, PBS洗3次, 6 min /次;加入5%脱脂乳( PBS配制)稀释的NS2多克隆抗体(1∶100),室温孵育2 h, PBS和PBST交替各洗涤2次, 8 min /次;用5%脱脂乳稀释Alexa Fluor 488标记的羊抗兔IgG为二抗(1∶1 000),室温避光孵育1. 5 h, PBS和PBST交替各洗涤2次, 8 min /次,全程避光;置于荧光显微镜下观察｡

1. 8 NS2蛋白同源性比对及序列分析

对18株国内外FCV毒株NS2氨基酸序列进行同源性比对分析,并构建系统发育树,同时比对分析NS2-N氨基酸保守性｡

2、结果与分析

2. 1 FCV NS2基因扩增FCV NS2基因截短表达示意如图1｡ 经特异性引物PCR扩增出目的片段,电泳结果显示, PCR产物与预期大小相符(图2)｡

图1 FCV NS2基因截短表达

图2目的基因PCR产物检测

2. 2重组基因表达质粒鉴定

测序结果显示,克隆至pET-32a ( +)载体的基因序列与原始毒株序列一致,表明原核表达质粒构建成功｡ 重组质粒双酶切产物电泳结果显示(图略),出现大小分别为5 900､858､528､330和690 bp的条带,分别与预期大小一致｡

2. 3重组蛋白诱导表达与条件优化

将测序正确的重组质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta (DE3)感受态细胞, IPTG诱导表达后,取部分菌液作全菌对照,其他菌液经超声离心后分离出上清液和沉淀,并进行12. 5% SDS-PAGE分析,考马斯亮蓝染色后显示,在32 kDa附近出现与NS2-N预期大小一致的条带,为上清液表达;在45 kDa附近出现与NS2-N-N预期大小一致条带,为沉淀表达(图3)｡ 重组蛋白诱导表达条件优化,结果表 明, pET - 32a - N的 最 佳 诱 导 条 件 为Rosetta(DE3)感受态细胞中加IPTG至终浓度为1 mmol / L,37℃诱导10 h; pET-32a-N-N的最佳诱导条件为Rosetta (DE3)感受态细胞中加IPTG至终浓度为2 mmol / L, 30℃诱导14 h｡

图3重组蛋白诱导表达的SDS-PAGE分析

2. 4多克隆抗体Western blot鉴定FCV- SH2014､FCV - FX5､FCV - GZ - VSD和FCV-F9感染CRFK细胞后不同时间点收样, Westernblot检测结果表明,制备的多克隆抗体能识别病毒NS2蛋白,具有良好的反应原性(图4)｡

2. 5多克隆抗体

IFA鉴定制备的多克隆抗体血清经1∶100稀释后作为一抗进行IFA检测｡ 感染FCV-SH2014的CRFK细胞内出现特异性绿色荧光信号,未感染病毒的阴性对照无特异性荧光信号(图5),表明制备的多克隆抗体能够识别FCV-SH2014｡1. 6 h; 2. 12 h; 3. 18 h; 4. 24 h｡A. FCV-SH2014感染; B. FCV-FX5感染; C. FCV-GZ-VSD感染; D. FCV-F9感染｡

图4 Western blot检测多克隆抗体对FCV感染细胞中NS2表达的识别

图5多克隆抗体的IFA鉴定(标尺= 100 μm)

2. 6 NS2蛋白序列分析比对

对18株FCV毒株的NS2-N进行氨基酸比对分析,其中FCV-FX5为基因Ⅱ型,其他毒株均为基因Ⅰ型｡ 比对结果发现NS2的N端除2个固定突变位点外,较为保守(图6)｡ 基于NS2蛋白氨基酸序列构建系统发育树,发现所选的4个毒株分布在各大分支(图7),进一步说明NS2多克隆抗体可以广泛应用｡图6 FCV毒株NS2-N氨基酸序列比对∗本研究所用毒株｡

图7 FCV毒株NS2序列系统遗传进化树

3、讨论

FCV在免疫压力下随着时间推移突变出多种可引起猫不同临床特征的新毒株,从传统的引起口腔溃疡和上呼吸道症状的毒株,逐渐突变出现引起猫严重下呼吸道症状,如肺炎的高致病性毒株,引起猫跛行的毒株和引起猫毒性系统性疾病的毒株等[10]｡ 由于FCV的高致突变性及其高遗传可塑性,使得病毒能够在猫科动物种群中成功生存,甚至在不产生症状的情况下,长期携带,对FCV引起的疾病的诊断､ 治疗和预防提出了特殊的挑战｡几十年来,作为杯状病毒属成员的FCV一直是研究杯状病毒生物学特性的最佳模型之一,因为它可以在细胞培养物中有效复制,并且已经开发了多个反向遗传系统[10-13]｡NS1 / 2､NS1､NS2和NS4的功能难以确定,因为与其他蛋白缺乏序列同源性｡ 即使在杯状病毒家族中,序列多样性也是差异很大,以至于除了来自密切相关病毒的序列外,非结构蛋白序列也无法用于产生有意义的系统发育树[14]｡尽管非结构蛋白NS1 / 2和NS4的功能尚不清楚,但最近的研究表明,其编码序列的突变可能会影响组织嗜性､ 毒力和流行病学适应性[15-16]｡ 对FCV和杜兰病毒观察到NS2蛋白具有低聚能力,在非还原条件下分离蛋白质并通过蛋白质印迹分析后,在来自转染细胞的裂解物中检测到NS2-NS2二聚体[17-18]｡ 诺如病毒和杜兰病毒NS1 / 2蛋白的NS2部分具有病毒孔蛋白活性,并非免疫细胞和上皮细胞之间基础Ca2+信号的差异[18-19],而且低聚功能是必不可少的,因此FCV的NS2蛋白可能具有病毒孔蛋白的活性｡ 研究发现NS2､NS3和NS4蛋白引起内质网(ER)产生膜囊泡｡ 因此,复制复合体形成的起始步骤可能发生在ER上,但随着该结构的成熟,分泌途径的其他成分也可能参与其中,而NS2作为复制复合体的中心,其潜在功能更具有研究意义[8, 20]｡为了进一步探究NS2蛋白在FCV增殖过程中发挥的作用,本研究在NS2蛋白全长无法表达的情况下,将NS2蛋白截短为2个片段,构建pET - 32a -NS2-N原核表达重组质粒,经多次诱导表达条件摸索, NS2-N (1~ 110 aa)蛋白成功在上清液中表达｡为确保多克隆抗体制备成功,将2个NS2-N通过柔性linker相连接,命名为NS2 -N-N,并构建pET -32a-NS2-N-N原核表达重组质粒,经诱导条件优化, NS2-N-N蛋白为包涵体表达｡ 通过初次免疫使用NS2-N重组蛋白,其后使用NS2-N-N蛋白进行免疫,成功获得了多克隆抗体, Western blot及IFA结果显示其特异性良好｡ 对18个FCV毒株的NS2进行比对,所选毒株FCV-SH2014､FCV-FX5､FCV-GZ-VSD和FCV-F9分散在各支,且各毒株NS2较为保守,表明以FCV-SH2014的NS2基因序列为基础表达蛋白所制备的多克隆抗体有广泛应用的价值,为研究FCV NS2蛋白功能､FCV检测及致病机制的研究提供了可靠的基础材料｡

参考文献:

[10]程杰.猫/兔杯状病毒变异株反向遗传操作平台的建立与应用[D].兰州:兰州大学, 2022.

[12]王颖.猫杯状病毒2280株感染致细胞凋亡的分子机制研究[D].哈尔滨:东北农业大学, 2023.

基金资助:国家重点研发计划项目(2022YFD1800100);国家自然基金面上项目(32272982);上海市自然基金项目(23ZR1477100);

文章来源:董宁宁,张琦,谈晓梅,等.猫杯状病毒NS2蛋白的截短表达及多克隆抗体的制备与应用[J].畜牧与兽医,2025,57(02):78-83.