非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的一种急性出血性传染病｡ASF是世界动物卫生组织法定通报的传染病,于2018年首次在中国沈阳出现[1],随后迅速席卷全国,给中国养猪业带来了巨大的经济损失[2-3]｡ 根据B646L基因序列差异,ASFV被分为24种基因型,我国主要流行基因Ⅰ型和Ⅱ型｡ 目前ASF无特效药和安全有效的商用疫苗,因此我国对ASF的防控主要依赖于严格的生物安全措施,包括人员车辆等严格消毒､ 封闭式管理猪场､严格的动物检疫及无害化处理等｡ASFV是具有囊膜的双链DNA病毒,病毒粒子呈现二十面体,基因组大小约170 ~ 190 kb,编码至少150~ 200个病毒蛋白[4],主要参与病毒复制､ 转录和翻译､ 病毒粒子的组装及免疫逃逸等过程[5]｡目前,约一半的蛋白功能不详或完全未知｡ 研究表明,基因缺失减毒苗能够提供完全同源保护,但存在毒力 返 强､ 无 交 叉 保 护 等 问 题[6-8]｡ 因 此,研 究ASFV未知蛋白功能,明确其在病毒感染中的作用,能够为研发疫苗提供新靶点｡pS183L是非洲猪瘟编码的非结构蛋白,蛋白大小约20 kDa,功能未知｡ 为探索pS183L在ASFV感染过程中的功能,本研究以pS183L为靶蛋白,制备多克隆抗体,经鉴定该多克隆抗体能用于检测外源性或ASFV感染的内源性pS183L,为深入研究pS183L的作用机制奠定了材料基础｡

1、材料与方法

1. 1病毒､ 细胞及实验动物

ASFV China / 2018 / Anhui XCGQ毒株､ 原代猪肺泡巨噬细胞(PAMs)由中国动物卫生与流行病学中心分离并保存｡ 大肠杆菌DH5α､Rosetta细胞､ 人肾上皮细胞(293T)､ 猪肾细胞( PK15)由本实验室保存｡4~ 6周龄SPF级BALB / c小鼠(雌性)来源于扬州大学比较医学中心｡ 本研究涉及的ASFV感染细胞试验在中国动物卫生与流行病学中心生物安全3级实验室中严格完成｡

1. 2主要试剂

限制性核酸内切酶BamHⅠ､XhoⅠ及T4 DNA连接酶均购自英国NEB公司｡ 蛋白纯化镍柱购自美国GE公司｡Alexa Flour 488绿色荧光标记的山羊抗鼠IgG (H+L)购自Invitrogen公司｡ 异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)购自Biosharp公司｡HRP标记的山羊抗鼠二抗购自Millipore公司｡ 鼠源Flag抗体､ 弗氏不完全佐剂和弗氏完全佐剂均购自美国Sigma公司｡p30和p72抗体由本实验室保存｡ 鼠源Actin抗体购自Proteintech公司｡TMB显色液购自天根生化科技(北京)有限公司｡

1. 3重组质粒pET-28a-S183L的构建

根 据NCBI公 布 的ASFV China / 2018 / AnhuiXCGQ (GenBank: MK128995. 1)中S183L基因的核苷酸序列,经DNAStar分析亲疏水性和抗原性,设计表达pS183L免疫原性较好区域(10 ~ 168 aa),引物设计为, F: 5′- CGCGGATCCTACTCTCTGAATAACT⁃GGGCAAGATAC - 3′(下划线处为BamHⅠ 酶切位点), R: 5′- CCGCTCGAGCAATTTTTCCAATCTCAA⁃GATATAGCC-3′(下划线处为XhoⅠ酶切位点)｡ 用实验室保存的真核表达质粒pcDNA3-2×Flag-S183L作为模板, PCR扩增靶序列｡ 双酶切载体pET- 28a和PCR回收产物, T4连接酶25℃ 连接30 min后,将连接产物转化入DH5α, 37℃ 培养于卡那抗性的LB固体培养基平板｡ 挑取单菌落进行PCR鉴定,并送至南京擎科生物公司测序,测序成功的重组质粒命名为pET-28a-S183L｡

1. 4重组蛋白的表达和纯化

将重 组 质 粒pET - 28a - S183L转 化 大 肠 杆 菌Rosetta, 37℃培养OD600 nm值至0. 6~0. 8,加入IPTG9 μL (终浓度1 mmol / L)诱导表达重组蛋白｡ 分别在诱 导 前 和 诱 导 后 的3､4､5､6 h取 样1 mL,12 000 r/ min离心3 min后弃上清液,加入200 μLPBS重悬菌体,再加入等量样品缓冲液于98℃ 变性10 min, SDS-PAGE鉴定重组蛋白的最佳诱导时间｡取诱导6 h菌液2 mL收集菌体, 400 μL PBS重悬并超声裂解菌体,待裂解充分后以12 000 r/ min离心3 min分离上清液和包涵体蛋白,包涵体蛋白用等体积PBS重悬,再分别加入样品缓冲液于98℃ 变性10 min, SDS-PAGE分析重组蛋白的可溶性｡ 以上述筛选的最佳诱导时间大量表达pS183L ( 250 mL),8 000 r/ min重复离心直至收集全部菌体,通过反复冻融 和 超 声 充 分 裂 解 菌 体,于8 000 r/ min离 心20 min收集含有目的蛋白的包涵体｡ 将包涵体蛋白4℃过夜溶解于7 mol / L尿素结合缓冲液中, 8 000r/ min离心10 min取上清液并过滤得到变性蛋白｡ 使用镍柱纯化并经尿素梯度稀释复性后得到纯化后重组蛋白｡

1. 5抗pS183L多克隆抗体的制备

纯化后pS183L与等体积的弗氏佐剂(弗氏完全佐剂首免,弗氏不完全佐剂二免)混匀并乳化后皮下免疫小鼠,第3次加强免疫腹腔注射纯化后蛋白｡每只小鼠免疫蛋白剂量为50 μg, 3次免疫时间间隔2周｡ 加强免疫2周后采血并处死小鼠,分离血清收集多克隆抗体｡

1. 6多克隆抗体的ELISA效价测定

使用碳酸盐缓冲液稀释纯化后pS183L至0. 5μg / mL, 4℃包被过夜｡ 弃掉包被液后加入3%脱脂乳37℃封闭1 h｡ 取1 μL收集的抗pS183L抗体加入999 μL PBST混匀,每孔加入100 μL稀释液,再倍比稀释至1∶128 000, 37℃ 孵育1 h｡PBST清洗3次后加入1∶5 000的山羊抗鼠二抗,再次以相同条件孵 育｡PBST清 洗3次 后 加 入TMB避 光 反 应,20 min后加入终止液终止显色,酶标仪读取OD450 nm值｡ 根据P / N≥2的最低抗体稀释度判定为该多克隆的效价｡

1. 7多克隆抗体的Western blot鉴定

将50%密度的293T和PK15细胞培养于3. 5 cm培养皿中, 24 h后转染真核质粒pcDNA3 - 2 ×Flag -S183L或pcDNA3 - 2 ×Flag 1 μg, 24 h后弃上清液,PBS清洗后加入200 μL样品缓冲液,收集细胞样,98℃变性10 min;将ASFV China / 2018 / Anhui XCGQ以MOI = 2分别感染PAMs 3､6､12､24､36 h后收集细 胞 样, 98℃ 变 性10 min,用 于Western blot鉴定｡将制备好的SDS-PAGE凝胶放入电泳槽,加入电泳缓冲液｡ 待检测样10 μL /孔,浓缩胶电压60 V,分离胶电压110 V｡ 待蛋白样电泳至凝胶底部转膜｡用三明治法即滤纸-NC膜-凝胶-滤纸包裹蛋白凝胶,放入垂直转印仪中,加入转印液, 200 mA恒流转印蛋白120 min｡ 待转膜结束后,室温3%脱脂乳封闭30 min, 4℃ 过夜孵育一抗( pS183L抗体稀释倍数1∶100, Flag抗体稀释倍数1∶3 000), 1×PBST洗膜3遍(分别洗10､10和15 min)后4℃ 孵育二抗(HRP标记山羊抗鼠IgG稀释倍数为1∶4 000) 4 h｡1×PBST洗膜(同上)后在化学发光液(ECL)作用下显色,在UVP成像仪中成像｡

1. 8多克隆抗体的IFA鉴定

将40%密度的293T细胞培养于加盖玻片的6 cm培养皿中, 24 h后转染质粒pcDNA3-2×Flag-S183L或pcDNA3-2×Flag 1. 5 μg｡ 转染后4 h换新鲜培养液,再继续培养20 h后弃上清液, PBS清洗1遍后加入4%甲醛, 37℃孵育30 min固定细胞｡Gly-PBS清洗2遍后, PBS清洗3遍｡ 加入3% BSA于4℃ 封闭过夜; 1∶100稀释的pS183L多抗加入对应的细胞孔中,设置Flag抗体(1∶200)作为对照, 37℃ 孵育1 h, PBS洗涤3遍,加入1∶500稀释的AlexaFlour 488标记山羊抗鼠IgG (H+L)抗体, 37℃ 孵育30 min, PBS洗涤后DAPI染核并封片,置于荧光显微镜下观察｡

2、结果与分析

2. 1重组蛋白

pS183L的免疫原性分析通过生物学软件DNAStar分析pS183L的亲疏水性和抗原性,预测发现pS183L的N端1 ~ 9 aa和C端169~183 aa具有强疏水性且免疫原性差(图1),因此选取pS183L 10~168 aa片段作为靶序列｡图1 pS183L氨基酸序列分析

2. 2 pET-28a-S183L原核表达质粒的鉴定

以pcDNA3-2×Flag-S183L质粒为模板, PCR扩增目的片段,并将其克隆至原核表达载体pET- 28a中｡ 菌落PCR凝胶电泳可见477 bp的条带,与预期大小一致(图2)｡

图2 pET-28a-S183L重组质粒菌落PCR的鉴定

2. 3 ASFV pS183L重组蛋白的表达和纯化

取IPTG诱导后6 h菌体超声裂解并离心,沉淀用PBS重悬｡SDS-PAGE分析pS183L的可溶性｡ 结果显示,该重组蛋白大小18 kDa,主要表达于包涵体内(图3)｡ 大剂量表达蛋白,经镍柱纯化､ 咪唑梯度洗脱后得到纯化的目的蛋白(图4)｡

图4 ASFV pS183L重组蛋白的纯化

2. 4多克隆抗体血清效价的测定

抗pS183L多克隆抗体倍比稀释至1∶128 000,加入到pS183L包被的ELISA板,酶标仪测定抗体效价,阴性对照为未免疫小鼠｡ 结果显示其制备的抗pS183L多克隆抗体效价大于1∶128 000 (图5)｡图5多克隆抗体血清效价测定

2. 5多克隆抗体的Western blot鉴定

用1∶1 000稀释的多克隆抗体对293T和PK15细胞过表达pS183L的蛋白样品和ASFV感染PAMs的不同时间点细胞样品进行鉴定｡ 结果显示,该多克隆抗体能识别过表达pS183L,该条带大小约21 kDa,与阳性对照Flag大小一致(图6A和6B)｡A. 293T细胞中过表达Flag-S183L蛋白的Western blot鉴定; B.PK15细胞中过表达Flag-S183L蛋白的Western blot鉴定; C. ASFV感染PAMs的Western blot鉴定｡

图6多克隆抗体的Western blot鉴定

在ASFV不同感染时间的结果中, 20 kDa左右出现单一条带,且随着感染时间表达量有增加,符合预期(图6C)｡ 以上结果说明该多克隆抗体可以用于pS183L的外源和内源性Western blot检测｡2. 6多克隆抗体的IFA鉴定用抗pS183L多克隆抗体( 1∶100)和抗Flag(1∶200)单抗对293T细胞过表达的pS183L进行鉴定｡ 试验结果表明,相比于对照组,抗pS183L多克隆抗体组出现特异性绿色荧光,且该定位与阳性对照Flag抗体组均定位于细胞质,表明该多克隆抗体可以用于IFA检测(图7)｡

图7多克隆抗体的IFA鉴定

3、讨论

2018年ASFV传入中国,由于缺乏有效的控制措施, ASFV在我国迅速传播｡ 早期分离鉴定的基因Ⅱ 型 毒 株ASFV - SY - 18､Pig / HLJ/ 2018､ASFVChina / 2018 / Anhui XCGQ[1,9-10]与Georgia / 2007 / 1毒株具有高度同一性,该类型病毒潜伏期短,致死率高,属于强毒株[10]｡2020年, Sun等[11]分离到22株基因Ⅱ型ASFV毒株与最早分离的高致死性毒株Pig / HLJ/ 2018相比,均发生了自然重组､ 突变､ 插入,表现为低毒力､ 持续感染｡2021年, Sun等[12]在山东和河南两地分离的中等毒力毒株被鉴定为ASFV基因 Ⅰ 型,该毒株引起的症状与 自 然 致 弱ASFV基因Ⅱ型相似,表现为慢性持续性感染｡2022年, Zhao等[7]发现高致病性ASFV基因Ⅰ型和Ⅱ型重组病毒,该重组体毒力相关基因来源于基因Ⅱ型病毒,但是基于ASFV基因Ⅱ型设计的减毒活疫苗不能对该重组病毒的攻击提供保护,自然致弱或重组ASFV的出现及流行给ASF的防控带来巨大的挑战｡pS183L在ASFV感染过程中的功能不详, Song等[13]通过Gaussia荧光素酶报告基因筛选试验,初步发现pS183L能显著激活NLRP3介导的炎症反应｡ 研究表明, ASFV编码部分蛋白参与调控炎症反应,如pMGF505-7R既能抑制NF-kB激活,也可与NLRP3相互作用抑制炎症小体的形成,进而影响IL-1β的成熟[14]; pH240R能与NLRP3相互作用抑制炎症小体的活化[15]; pC84L能激活半胱天冬酶1 (Caspase-1)促 进IL - 1β的 成 熟[16]｡ 而pS183L如 何 参 与ASFV感染调控炎症反应的分子 机 制 有 待 进 一 步研究｡制备ASFV编码蛋白抗体是研究该蛋白功能的基础｡ 为了制备该蛋白抗体,本研究运用生物学软件DNAStar分析pS183L的抗原性和亲疏水性,选取10~168 aa区域为靶抗原序列,构建重组质粒pET-28a-S183L,保证重组蛋白更好的免疫原性｡Westernblot结果表明,本研究制备的pS183L多克隆抗体能够特异 性 识 别 瞬 时 转 染 细 胞 中 表 达 的pS183L和ASFV感染PAMs的内源性pS183L｡Zheng等[17]对ASFV感染PAMs不同时间的单细胞转录组测序结果显示, pS183L在ASFV感染10 h左右开始大量表达｡与转录组学结果一致,本研究制备的多克隆抗体在ASFV感染12 h的PAMs中即可识别到pS183L蛋白的表达,表明该多克隆抗体识别能力较强,后续本试验也将考虑制备单克隆抗体以获得更稳定的特异性抗体｡目前pS183L在ASFV感染中的具体功能仍不清楚,本研究利用原核表达系统成功表达pS183L,并成功制备抗pS183L的多克隆抗体｡ 经验证该抗体可用于Western blot和IFA试验,为进一步研究pS183L蛋白功能奠定了基础｡

参考文献:

[16]唐静,马旭升,石正旺,等.非洲猪瘟病毒C84L蛋白通过激活NLRP3炎症小体上调炎症因子的表达[ J].中国兽医科学,2024, 54 (1): 1-11.

基金资助:国家重点研发计划资助项目(2021YFD1801200);江苏省重点研发计划(现代农业)重点项目(SBE2020310346);

文章来源:余群,邹艳丽,陈欢,等.非洲猪瘟病毒蛋白pS183L的原核表达及多克隆抗体制备[J].畜牧与兽医,2025,57(02):112-117.