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登革病毒2型抗体ELISA检测方法建立及型特异性抗原片段的鉴定

2020-05-23 272 上传者：管理员

摘要：目的筛选、鉴定登革病毒（Denguevirus,DENV)2型（DV2）型特异性抗原片段；建立优化检测DV2抗体的ELISA方法，并进行临床应用验证。方法采用生物信息学方法分析1～4型（DV1～DV4）及其相近虫媒病毒基因组序列，选择预测得分较高且在不同DV2流行株中高度保守的表位；利用pMal-c2x表达系统制备其原核表达抗原，Westernblot法分析其免疫原性；建立优化检测DV2抗体的ELISA方法，并验证方法的特异性及灵敏性；应用优化的方法检测33份各型登革热（Denguefever,DF）确诊患者及30份健康体检人群血清样本。结果经生物信息学分析，预测获得DV2特异性抗原表位12段，预测得分值较高的8段（E123～128、E131～135、E143～149、E223～229、E286～294、E340～347、E383～387及E391～398）重组表达载体经双向测序证实读码框架准确，经Westernblot分析，包含抗原位点E143～149区域的融合表达片段D2Ag3仅与DV2多克隆抗体发生免疫反应。ELISA优化条件为抗原包被浓度2μg/mL,4℃包被24h,37℃封闭2h；经该方法分析，D2Ag3原核表达抗原与DV2多克隆抗体反应的A450≥1.37，与其他20种多克隆抗体反应的A450均≤0.04,DV2多克隆抗体在40～20480倍稀释范围内，均可获得阳性检测结果。63份临床阳性样本A450>0.32，阴性样本A450<0.12，检测样本/阴性对照比值（sample/negative,S/N)>2.1。结论成功筛选鉴定了DV2型特异性抗原片段，初步建立了DV2IgG抗体的ELISA检测方法，该方法具有良好的特异性及灵敏性，为DF的鉴别诊断提供了技术手段。

关键词：
原核表达
型特异性抗原
生物信息学方法
病毒学
登革病毒2型
酶联免疫吸附测定
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登革病毒（Denguevirus,DENV）属黄病毒科黄病毒属，主要传播媒介为埃及伊蚊及白纹伊蚊。据世界卫生组织统计，全球每年感染人口达5000万～1亿，超过100个国家的25亿人口正在受到威胁，仅次于疟疾的重要热带病，对流行区国家的医疗卫生体系造成沉重负担[1]。DENV致病机制复杂，可引起登革热（Denguefever,DF）、登革出血热（Denguehemorrhagicfever,DHF）及登革休克综合征（Dengueshocksyndrome,DSS）等多种症状[2]。不同学者的研究均表明，其临床症状的差异可能与二次异型DENV感染而导致的抗体依赖性增强作用有关[3,4,5]，而目前仍缺乏简便、可靠的DENV血清学分型手段，不利于该类疾病的流行病学调查及临床治疗。根据DENV包膜E蛋白抗原性的不同，可分为登革1～4血清型（DV1～DV4），在全球热带、亚热带地区均有流行。近年来，随着气候变暖及人口流动加速，其流行范围有日益扩大的趋势。国内自1978年广东佛山首次暴发DF疫情以来，历经多次大的流行，2014年再次在广东省多个地区大规模暴发，发病人数超过4万，对当地卫生防疫工作造成严重负担[6]。

本研究在对中国DENV流行株遗传变异规律长期检测、分析的基础上[7]，参考GenBank中重要黄病毒属虫媒病毒核酸序列，对DV2抗原表位进行系统的生物信息学分析，筛选有意义的抗原区域进行原核表达及鉴定，优化建立DV2抗体ELISA检测方法，为其免疫学诊断试剂研制及进一步探讨DENV致病机制提供参考。

1、材料与方法

1.1菌毒株、细胞及载体

DV1[GD03/91株（GenBank:FJ196845）、GD01/97株（GenBank:FJ196847）、GD01/2006株（GenBank:FJ196843）]、DV2[GD01/93株（GenBank:FJ196853）、GD08/98株（GenBank:FJ19-6851）、GD01/2001(GenBank:FJ196852)][8]、DV3(2013年云南株）、DV4(GenBank:GD07/78）及鹭山病毒M1株（M1)[9]均由南部战区疾病预防控制中心分子生物学研究室分离鉴定保存；流行性乙型脑炎病毒（JEV，中山株）、黄热病毒（YFV,17D株）、西尼罗病毒（WNV）、墨累山谷脑炎病毒（MVEV）、森林脑炎病毒（TBEV）、兰加特病毒（LANV）、玻瓦桑病毒（POWV）、科萨努尔森林脑炎病毒（KFDV）、基孔肯雅（CHIKV,WJ0601株）、辛德毕斯病毒（SINDV）、盖塔病毒（GETV）、罗斯河病毒（RRV）、鹭山病毒（SAGV）、西门利克病毒（SFV）、马雅罗病毒（MAYV）及布尼安病毒科巴泰病毒（BATV）标准株均由中国食品药品检定研究院提供，由南部战区疾病预防控制中心分子生物学研究室传代保存；表达宿主菌Rosetta(DE3）由南部战区疾病预防控制中心分子生物学研究室传代保存；S180细胞及C6/36细胞培养上清液由军事医学科学院微生物与流行病研究所惠赠。

1.2实验动物

昆明鼠（SPF级，雌性，6～8周龄，体重20～25g）及昆明乳鼠（SPF级，3日龄，体重1.5～2g）均购自南方医科大学实验动物中心，动物生产许可证：SCXK（粤）2016-0041。

1.3主要试剂

病毒RNA提取试剂盒（PureLinkTMViralRNA/DNAMiniKit）及RT-PCR试剂盒（SuperScriptTMⅢOne-StepRT-PCRSystemwithPlatinumTMTaqDNAPolymerase）购自美国Invitrogen公司；pMalc2x表达系统及Amylose树脂购自美国NewEnglandBiolabs公司；EcoRⅠ、BamHⅠ、HindⅢ及T4DNA连接酶均购自大连TaKaRa公司；琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒及质粒快速提取试剂盒均购自美国Omega公司；HRP标记羊抗鼠IgG及HRP标记兔抗人IgG购自武汉博士德生物工程有限公司；胰化蛋白胨及酵母提取物购自英国Oxoid公司。

1.4DV2特异性抗原表位的生物信息学分析

采用ANTHEPROT5.0及DNAStarprotean7.1软件系统，分析DV2参考株编码蛋白的亲水性、抗原性、可塑性及表面可能性，同时考虑是否含有易形成抗原表位的β转角及无规则卷曲结构，初步预测可能的抗原表位。并参考相近虫媒病毒YFV、JEV、DV1、DV3、DV4型编码蛋白序列，根据其与所获DV2抗原表位氨基酸的序列及性质的差异，进一步筛选DV2型特异性抗原表位，并与GenBankDV2代表性毒株进行多序列比对分析，鉴定其在其他株系中的保守性，以筛选广覆盖面的DV2型特异性抗原表位。

1.5特异性抗原片段的原核表达

根据预测得分较高的DV2型特异性抗原表位设计引物，并于其5′端引入BamHⅠ酶切位点，3′端引入HindⅢ酶切位点及终止密码子TAA。按病毒RNA提取试剂盒说明提取病毒RNA，进行RT-PCR；扩增片段经纯化、回收后，克隆至pMal-c2x载体，构建原核表达载体。选取阳性克隆送生工生物工程（上海）有限公司测序，读码框架确定无误后，转化Rosetta(DE3）表达宿主菌，IPTG诱导表达；融合表达片段命名为D2Ag3(PHSGEEH），预期相对分子质量在45000～50000之间，12%SDS-PAGE分析重组抗原表达情况。

1.6病毒多克隆抗体制备

将DV1～DV4、JEV、WNV、YFV、MVEV,CHIKV、RRV、GETV、SINDV、SAGV、MAYV、SFV、TBEV、LANV、POWV、KFDV、M1及BATV用C6/36细胞培养上清液100倍稀释，皮下多点免疫昆明乳鼠10～12只，200μL/只；待规律发病后取鼠脑研碎，离心取上清，用1×PBS进行10倍稀释，皮下多点注射免疫昆明鼠10～12只，300μL/只；每7d免疫1次，4次免疫后腹腔注射1.0×107cells/mLS180细胞，0.5mL/只，3～5d后收集腹水，即为病毒多克隆抗体。采用免疫荧光法测定抗体效价。

1.7重组抗原的Westernblot分析

表达蛋白经12%SDS-PAGE分离后，湿法转印至硝酸纤维素膜，分别以DV1～DV4、JEV、YFV及WNV多克隆抗体（1∶1000稀释）为一抗，HRP标记羊抗鼠IgG为二抗（1∶5000稀释），分析重组抗原的反应原性。

1.8重组抗原的纯化

将鉴定正确的阳性菌株接种LB液体培养基，经IPTG诱导、超声破碎后，采用Amylose树脂纯化重组抗原，并进行12%SDS-PAGE分析。

1.9ELISA检测方法的建立及优化

重组抗原按一定浓度包被酶标板，对包被条件、封闭条件进行系统优化，以制备的多克隆抗体为一抗（1∶1000稀释），HRP标记羊抗鼠IgG为二抗（1∶5000稀释），450nm波长下测定吸光度值。判定标准：A450>0.15，且检测标本/阴性对照比值（sample/negative,S/N)>2.1的样品为阳性样品。

1.9.1包被温度及时间的优化

重组抗原4℃分别包被4、8、16、20、24、28h及37℃包被2、4、6、8、10、12h。

1.9.2包被浓度的优化

D2Ag3原核表达抗原分别按16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/mL浓度包被酶标板。

1.9.3封闭时间的优化

37℃分别封闭1、2、3、4、5、6h，共6个试验组。

1.10ELISA方法的特异性及灵敏性验证

将D2Ag3抗原按1.9项ELISA法的优化条件包被、封闭；以1.6项制备多克隆抗体为一抗（1∶1000稀释），验证方法的特异性；将DV2多克隆抗体由40倍起系列倍比稀释，验证方法的灵敏性。

1.11方法的应用

以HRP标记兔抗人IgG为二抗（1∶5000稀释），采用建立的ELISA方法对各型DF实验室确诊血清33份（广东2014年DV1感染患者血清15份，广东2001年、云南2013年DV2感染患者血清12份和2份，2013年云南DV3感染患者血清4份）及30份健康体检人群血清标本进行检测，评估检测方法的准确性。

2、结果

2.1抗原表位预测及其原核表达

经系统的生物信息学分析，预测获得DV2特异性抗原表位12段，预测得分值较高的8段（E123～128、E131～135、E143～149、E223～229、E286～294、E340～347、E383～387及E391～398）重组表达载体经双向测序证实读码框架准确；经多序列比对分析，表明该区域在DV2不同流行株中相对保守，具备较高的覆盖面；SDS-PAGE分析表明，8株诱导菌于设计位置均出现特异性表达条带（图略），与预期结果相符，表达量在40%以上。

2.2重组抗原的Westernblot分析

包含抗原位点E143～149区域的融合表达片段D2Ag3(PHSGEEH）与DV2多克隆抗体有明显的免疫反应，而与其他抗体均无明显的交叉反应，见图1。

2.3重组抗原的纯度

经12%SDS-PAGE分析，纯化的D2Ag3原核表达抗原纯度在90%以上。

2.4ELISA检测方法的优化

2.4.1包被温度及时间

37℃包被10h、4℃包被24h,A450均达到峰值；阳性样品A450均为2.50;37℃阴性样品A450在0.088～0.148之间，4℃阴性样品A450在0.065～0.095之间。见图2。最终确定包被条件为4℃包被24h。

图1重组原核表达抗原的Westernblot分析

图2ELISA反应包被条件优化结果

2.4.2包被浓度

结果显示，抗原包被浓度在0.25～2μg/mL时，A450呈上升趋势，2μg/mL抗原的A450达到峰值，在2～4μg/mL浓度范围内保持相对稳定，随后随着包被浓度增加，A450稍有下降，见图3。确定最适包被浓度为2μg/mL。

图3包被抗原浓度优化结果

2.4.3封闭时间

6个试验组阳性样品A450在（3.047±0.149)～(2.680±0.110）之间，阴性样品A450在（0.079±0.003)～(0.095±0.004）之间，不同封闭时间的A450差别不显著，见表1。综合考虑选择37℃封闭2h。

表1D2Ag3原核表达抗原的A450

2.4.4ELISA优化条件

经系统优化后，确定的ELISA反应条件为：2μg/mL纯化重组抗原蛋白包被酶标板，100μL/孔，4℃包被24h；封闭液200μL/孔，37℃封闭2h，充分干燥后备用。

2.5ELISA方法的特异性

经ELISA分析，D2Ag3原核表达抗原与DV2多抗反应的A450≥1.37，与其他相近虫媒病毒多抗反应的A450均≤0.04;S/N>30。见表2。

2.6ELISA方法的灵敏性

结果显示，抗体在40～20480倍稀释范围内，均可获得阳性检测结果；抗体在40～80倍稀释范围内，ELISA反应A450相对稳定，在3.32～3.47之间，随着抗体稀释倍数的增加，A450逐步降低，2560倍稀释后，其A450仍在1.1以上，稀释至20480倍以后，A450降至0.28，随后进入检测灰区。见图4。

表2D2Ag3原核表达抗原ELISA分析

图4ELISA检测方法的灵敏性

2.7ELISA方法的临床应用

D2Ag3抗原与DV1、DV3感染患者血清无交叉反应，其A450均在0.1以下，12份DV2感染患者血清中，11份检测阳性A450在0.53～1.97之间，其中1份1993年DV2感染患者血清的A450相对较低，为0.32;30份健康体检人群样本中1份检测阳性，A450为0.535，其余样本均呈阴性，A450在0.05～0.12之间。该结果与采用免疫荧光及商品化试剂盒的复核结果一致。

3、讨论

DENV致病机制复杂，有研究表明，其编码蛋白存在群特异性及型特异性抗原表位，群特异性表位可能在DSS及DHF的发病机制中起重要作用，二次异型DENV感染可导致严重的DSS/DHF[10,11,12]。随着DF感染人口基数的增多，出现二次异型DENV感染进而发展为DSS/DHF病例的几率日渐增加，准确评价患者免疫状态，确定是否二次感染，可为临床治疗提供重要依据。同时，在广泛开展的流行病学调查工作中，也需要准确有效的DENV血清学分型手段。目前，确定DENV二次感染产品主要通过检测IgG抗体出现的时间及强度判断，由于临床上患者自身对发病时间的判断可能存在误差，导致诊断结果存在不确定性[13]。通过直接检测患者体内异型DENV抗体的有无来判断二次感染，可信度更高，并且受检测条件限制较小。在DENV的免疫学分型的研究方面，由于黄病毒属病毒之间具有严重的免疫交叉反应，而DV1～DV4之间交叉尤为严重，这些均对其抗原的特异性提出了更高的要求[14]。

本研究在保证DV2免疫反应亲和力的前提下，尽量缩短了抗原片段长度，以减少非特异性反应，经生物信息学筛选，鉴定DV2型特异性抗原表位E143～149区域的融合表达片段D2Ag3(PHSGEEH）具有良好的免疫原性，与其他20种相近虫媒病毒无交叉反应，具有良好的特异性。建立优化了检测DV2感染的ELISA方法，该方法的特异性及灵敏性良好，为下一步试剂盒的研制奠定了良好基础，并为进一步探讨该表位的生物学功能提供了参考。

参考文献：

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