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轮状病毒在潮汐式生物反应器CelCradleTM培养的工艺探究

2020-05-23 254 上传者：管理员

摘要：目的建立潮汐式生物反应器CelCradleTM培养轮状病毒的工艺。方法利用500mL的潮汐式生物反应器CelCradleTM培养Vero细胞，通过葡萄糖含量监测及活细胞计数进行换液，待活细胞数目达2.75×109个时，分别按0.01、0.05、0.1和0.2MOI接种轮状病毒ZTR-68株，于37℃，5%CO2培养箱中培养7d，每天取样，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测病毒基因组核酸带型，免疫荧光法检测病毒增殖情况，透射电镜观察病毒的形态结构，蚀斑法检测病毒滴度，确定生物反应器CelCradleTM培养轮状病毒的最适MOI。结果在CelCradleTM反应器中接种3×108个Vero细胞，经7d培养，活细胞数目可达2.75×109个；以0.05MOI轮状病毒ZTR-68接种Vero细胞的病毒基因组带型与转瓶培养的保持一致，感染后3～5d，轮状病毒荧光阳性细胞数目最多，电镜下可见形态结构完整的轮状病毒颗粒；以0.05MOI接种轮状病毒ZTR-68株96h病毒滴度最高，为7.7LogPFU/mL。结论初步建立了潮汐式生物反应器CelCradleTM培养轮状病毒的工艺，为进一步大规模生产轮状病毒灭活疫苗奠定了实验基础。

关键词：
Vero细胞
潮汐式生物反应器
病毒学
轮状病毒
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轮状病毒是引起5岁以下婴幼儿急性肠胃炎最主要的病原体[1]。每年有约21.5万婴幼儿死于轮状病毒感染，给社会造成了严重的经济负担[2]。目前尚无特效药治疗轮状病毒感染，主要通过轮状病毒疫苗进行预防[3]。

轮状病毒疫苗生产早期采用转瓶培养工艺。该工艺细胞生长密度低，贴壁不均一，耗费大量人力和空间，难以规模化生产。后来又采用细胞工厂和生物反应器微载体培养轮状病毒[4,5,6]。细胞工厂将细胞连续浸没在无通气的浅培养基中，无任何搅动，病毒滴度较低；而微载体技术虽然通过培养基的连续搅拌实现营养物质和氧气的交换，但这种搅拌对细胞产生一定的剪切应力，会引起细胞死亡，导致病毒产量降低。因此，开发新型轮状病毒培养方式已成为一种趋势。

CelCradleTM生物反应器是一款高密度细胞培养的台式生物反应器[7,8,9,10,11]，其通过培养基和空气的潮汐式运动，增强细胞和病毒对营养物质的利用。生物反应器中含有BioNOCTMII载体，其为一种100%聚对苯二甲酸乙二醇酯（polyethyleneterephthalate,PET）纤维培养基质，这种纤维状的载体大大提高了细胞附着和生长的表面积。本研究首次采用潮汐式生物反应器CelCradleTM培养轮状病毒，以期为轮状病毒疫苗的研发奠定一定的基础。

1、材料与方法

1.1细胞及毒株

Vero细胞（142代）和MA104细胞（61代）由医学生物学研究所分子生物室保存；轮状病毒ZTR-68毒株为G[1]P[8]型野生型毒株，由医学生物学研究所分子生物室从云南省昭通市一名婴幼儿的粪便中分离培养得到，代次为P16。

1.2主要试剂及仪器

MEM培养基由医学生物学研究所提供；新生牛血清购自兰州民海生物工程有限公司；激活用胰酶购自美国GIBCO公司；FITC标记的兔抗山羊IgG购自美国JacksonImmunoResearch公司；病毒RNA提取试剂盒购自美国Thermoscientific公司；CVD细胞裂解液、生物反应器CelCradleTM和葡萄糖检测仪GlucCellTM均购自Esco公司；低熔点琼脂糖购自美国Lonza公司；中性红购自美国Sigma公司。

1.3细胞培养

将3×108个/50mLVero细胞接种于CelCradle-500细胞瓶中，补足生长液（含8%新生牛血清的MEM）至500mL，旋上透气盖，装载入CelCradleStage-3000仪器中，吸附5h，运行程序为：上行速度1.0mm/s，顶端停留10s；下行速度1.0mm/s，底端停留0s。吸附5h后，计算Vero细胞的吸附率（载体上的细胞数/接种细胞总数×100%）。细胞连续培养7d，运行程序为：上行速度1.0mm/s，顶端停留10s；下行速度1.0mm/s，底端停留20s。

1.4葡萄糖含量的测定

每天取培养液，用葡萄糖检测仪GlucCellTM检测培养基中葡萄糖含量，若葡萄糖含量低于1g/L时，弃去旧培养液，更换新的生长液500mL。

1.5细胞培养过程中活细胞计数

每天取载体2片，装入1.5mL离心管中，加入CVD细胞裂解液1mL，振荡1min,37℃水浴放置30min，取出振荡1min，再次于37℃水浴放置30min，经适量稀释后，加入细胞计数板进行活细胞计数。

1.6病毒培养

当Vero细胞培养至2.75×109个细胞时，用不含新生牛血清的MEM培养基洗涤1次。轮状病毒ZTR-68经胰酶激活后，接种于Vero细胞，于37℃，5%CO2培养箱中倒置吸附120min，加入含0.5μg/mL胰酶的MEM维持液培养，运行程序为：上行速度1.0mm/s，顶端停留10s；下行速度1.0mm/s，底端停留20s。每天取样，进行各项鉴定。

1.7病毒基因组核酸带型检测

将轮状病毒按0.05MOI接种于Vero细胞，按照1.6项方法培养，每天取样，共7d。参照GeneJETViralDNAandRNAPurificationkit说明书提取病毒基因组RNA，经90V聚丙烯酰胺凝胶电泳8h，硝酸银染色检测病毒基因组核酸带型。

1.8病毒增殖的检测

采用免疫荧光法。将轮状病毒按0.05MOI接种于Vero细胞，按照1.6项方法培养，每天取样，共7d。将MA104细胞接种于6孔板中，置37℃，5%CO2培养箱内培养；待细胞长成致密单层，取经10μg/mL胰酶激活的轮状病毒培养上清接种于MA104细胞，置37℃，5%CO2培养箱中培养过夜；将MA104细胞用4%多聚甲醛和甲醇固定后，加入ZTR-68毒株免疫山羊获得的多克隆血清（本实验室制备，1∶500稀释），37℃孵育2h；再加入FITC标记的兔抗山羊IgG(1∶1000稀释），37℃孵育1h，同时设阴性细胞对照。荧光显微镜下观察病毒增殖情况。

1.9病毒的电镜观察

将轮状病毒按0.05MOI接种于Vero细胞，按照1.6项方法培养4d，取病毒收获液，负染后经透射电镜观察。

1.10病毒最佳接种MOI的确定

将轮状病毒分别按0.01、0.05、0.1、0.2MOI接种于Vero细胞，按照1.6项方法培养，每天取样，共7d。采用蚀斑法检测病毒滴度：将生长状态良好的MA104细胞接种于6孔板中，置37℃，5%CO2培养箱内培养，待细胞长成致密单层，将经胰酶激活的待测样品10倍稀释后，接种于6孔板细胞上，37℃吸附120min；每孔加入含1%琼脂糖的维持液，倒置于37℃，5%CO2培养箱中培养3～4d；每孔加入含1%琼脂糖和中性红的维持液，倒置于37℃，5%CO2培养箱中继续培养3～4d，观察蚀斑形成，并按下式计算病毒滴度（PFU/mL），同时设2孔细胞对照，确定用生物反应器CelCradleTM培养轮状病毒的最适MOI。

2、结果

2.1Vero细胞在CelCradle-500细胞瓶中的生长曲线

Vero细胞接种于CelCradle-500细胞瓶吸附5h后，经活细胞计数，有1.3×108个细胞吸附到载体上，吸附率为43.3%；细胞接种1d后，载体上细胞数量达2.2×108个，葡萄糖含量由接种前的3000mg/L降至2450mg/L；培养至2d，细胞数量达5.5×108个，葡萄糖含量降至2000mg/L；培养至3d，细胞数量达1.1×109个，葡萄糖含量降至950mg/L，首次更换培养液。随着细胞数量的增加，营养物质消耗速度逐渐增加，3d后必须每隔1d进行换液。细胞接种7d后，细胞数量达2.75×109个，相当于27个转瓶细胞的总和。此后，由于营养物质消耗及生长空间的限制，细胞增殖到达平台期，速度逐渐减慢。见图1。

图1Vero细胞在CelCradle-500细胞瓶中的生长曲线及葡萄糖浓度

2.2病毒基因组核酸带型检测

轮状病毒接种于Vero细胞后，每隔24h提取的病毒基因组经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析显示，电泳条带排列为4-2-3-2型，与转瓶培养的轮状病毒ZTR-68RNA基因组带型保持一致，见图2。

图2轮状病毒ZTR-68基因组核酸带型

2.3病毒增殖的检测

荧光显微镜下观察显示，0.05MOI轮状病毒感染Vero细胞后1d可观察到病毒的增殖；随着感染时间的延长，轮状病毒荧光阳性的细胞数目增加；感染后3～5d，阳性细胞数目最多；感染后6d，阳性细胞数目逐渐减少。见图3。

图3轮状病毒ZTR-68感染Vero细胞后不同时间的免疫荧光分析

2.4病毒的电镜观察

0.05MOI轮状病毒感染Vero细胞4d后，电镜观察可见大小约75nm，形态结构完整的轮状病毒颗粒，见图4。

图4轮状病毒ZTR-68的电镜观察

2.5病毒最佳接种MOI的确定

以不同MOI轮状病毒感染Vero细胞后3～4d，病毒增殖达高峰，随后逐渐下降。其中，以0.05MOI病毒感染细胞后4d，病毒收获液的滴度最高，达7.7LogPFU/mL。见图5。因此确定轮状病毒ZTR-68在Vero细胞上的最佳接种MOI为0.05，最佳培养时间为4d。

图5接种不同MOI轮状病毒ZTR-68的增殖曲线

3、讨论

规模化培养病毒在疫苗生产过程中极其重要。目前主要采用转瓶工艺生产轮状病毒。潮汐式生物反应器CelCradleTM培养轮状病毒的原理与转瓶系统非常相似，均是交替地将细胞暴露于空气与营养物质中。但潮汐式生物反应器CelCradleTM克服了转瓶系统的很多缺点：(1)1个500mL的培养瓶可替代约27个850cm2的转瓶，减少了人力和空间的占用；(2)比转瓶系统操作相对简单，降低了污染的概率；(3)采用潮汐式原理，增强了细胞和病毒对营养物质的利用，降低了培养基（如血清等）的消耗，大大降低了生产成本；(4)使用CelCradleTM生产轮状病毒滴度可达7.7LogPFU/mL,1个500mL的CelCradleTM培养瓶相当于2.5×1010PFU的病毒颗粒，而1个转瓶的病毒产量只能达到5×108PFU的病毒颗粒，因此，1个500mL的CelCradleTM培养瓶培养轮状病毒的产量相当于约50个转瓶，这样高滴度的病毒有利于简化轮状病毒疫苗后续的生产工艺。

综上所述，本实验初步建立了潮汐式生物反应器CelCradleTM培养轮状病毒的工艺，为进一步大规模生产轮状病毒灭活疫苗奠定了基础。

参考文献：

[4]安红,张海红,王名强,等.细胞工厂培养轮状病毒基因重配株Ls(G3型)条件的优化研究[J].微生物学免疫学进展,2014,42(1):25-30.

[5]张永欣,刘馨,张光明,等.Vero细胞微载体技术规模化培养轮状病毒[J].中国生物制品学杂志,2008,21(4):336-337.

[6]范秀娟,孙燕,孙振鹏,等.生物反应器培养轮状病毒基因重配株Ls条件的优化[J].微生物学免疫学进展,2015,43(6):18-21.

[7]马良,田宇婧,周建民,等.采用潮汐式生物反应器进行ST细胞培养的研究[J].中国农学通报,2012,28(5):53-56.

尹娜,周艳,刘洋,胡晓青,张光明,孙茂盛,李鸿钧.潮汐式生物反应器CelCradle~(TM)培养轮状病毒工艺的建立[J].中国生物制品学杂志,2020,33(05):554-557+562.