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基于分子生物学及病原学角度进行巴氏杆菌的鉴定分析

2020-06-11 494 上传者：管理员

摘要：为确定湖南某鸡场鸡群突然发病死亡的原因,对病料进行细菌分离鉴定,对获得的分离菌株G-2进行了病原学和分子生物学的系统鉴定。通过16SrDNA鉴定和Biolog鉴定,表明该病原菌为多杀性巴氏杆菌杀禽亚种;采用荚膜多重PCR分型、脂多糖多重PCR分型和多位点序列分型对其基因型进行了鉴定,结果显示该菌株为荚膜A型、脂多糖L1型、ST129型。利用SPF鸡进行动物回归试验,结果证实该菌株能引起SPF鸡典型的禽霍乱症状,肌肉注射7CFU活菌可致死78日龄SPF鸡,10CFU活菌可致死114日龄SPF鸡。结合临床症状和病理变化,表明引起鸡群死亡的病原为多杀性巴氏杆菌。

关键词：
分子生物学
多杀性巴氏杆菌
病毒学
禽霍乱
鉴定
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禽霍乱是由多杀性巴氏杆菌引起的多种禽类的出血性败血症,是危害我国养禽业的重要细菌性传染病之一,鸡、鸭和鹅等都有易感性[1]。病禽、康复禽或健康带菌禽是本病的主要传染源,禽霍乱造成鸡的死亡损失通常发生于产蛋鸡群。本文采用细菌分离培养、16SrDNA、Biolog、荚膜分型多重PCR、脂多糖多重PCR、动物试验等方法对湖南某鸡场病死鸡体内分离的1株菌株G-2进行了病原学和分子生物学系统鉴定。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1病料

无菌采集湖南某鸡场病死鸡的肝、脾和心血等,置4℃冰箱待检。

1.1.2菌种

试验参考菌株多杀性巴氏杆菌CVCC390,荚膜A型,由中国兽医微生物菌种保藏管理中心提供。

1.1.3培养基和试剂

胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)购自OXOID公司,马丁肉汤购自北京中海生物科技有限公司,BUG培养基购自美国Biolog公司,马血清购自Gibco公司,革兰染色液试剂盒购自Solarbio公司,PCR相关试剂、琼脂糖购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.1.4实验动物

78和114日龄SPF鸡购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2方法

1.2.1菌株的分离及纯化

按照农业行业标准NY/T541-2016[2],无菌采集死亡鸡的肝、脾和心血,将病料少许接种于TSB中,37℃培养16～24h,用一次性接种环挑取培养物划线接种含5%鸡血清的TSA培养基,37℃培养16～24h,挑取单个菌落进行纯化培养。

1.2.2菌株的培养及观察

菌株划线接种含5%鸡血清的TSA培养基,37℃培养24h,进行菌落形态及培养特性观察,用一次性接种环蘸取少量培养物进行革兰染色,观察染色特性及菌体形态。

1.2.3菌株DNA的提取

采用热裂解法提取菌株DNA,用枪头挑取菌株TSA培养物加入到含100μL无菌去离子水的离心管中,反复吹打,沸水浴10min后立即放入-20℃冰箱冷冻5min,然后放入高速离心机12000r/min离心1min,上清液即为PCR扩增用DNA模板。

1.2.4菌株16SrDNA鉴定

PCR扩增用引物27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,1492R:5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反应体系(50μL):10×ExBuffer5μL,dNTP(2.5μmol/L)4μL,引物27F(10μmol/L)1μL,引物1492R(10μmol/L)1μL,ExTaq酶(5U/μL)0.25μL,DNA模板2μL,补加无菌去离子水至50μL。PCR扩增条件:94℃预变性5min;94℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸90s,共30个循环;最后72℃延伸10min。PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物送交中美泰和生物技术(北京)有限公司进行序列测定。将序列提交到http://www.ezbiocloud.net/identify进行序列比对,用Mega7.0软件分析序列的同源性,并构建系统发育树。

1.2.5菌株Biolog鉴定

挑取活化的菌株TSA平板上的单菌落划线接种BUG培养基(含5%脱纤绵羊血)过夜培养,用无菌棉拭子蘸取单菌落加入到接种液A中,调整浊度至96%,用移液器将菌悬液加入GenⅢ鉴定板中,每孔100μL,放入湿盒中,置于36℃过夜培养后,用Biolog微生物鉴定仪读取结果。

1.2.6菌株荚膜多重PCR分型

荚膜分型引物合成参考文献[3],多杀性巴氏杆菌A、B、D、E、F血清型特异性基因片段hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecbJ、fcbD引物序列见表1。取菌株DNA模板2μL加入到如下50μL反应体系中:10×ExBuffer5μL,dNTP(2.5μmol/L)4μL,上游引物(10μmol/L)各2μL,下游引物(10μmol/L)各2μL,ExTaq酶(5U/μL)0.5μL,补加无菌去离子水至50μL,置于PCR仪中依照下述参数扩增:94℃预变性5min;94℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸60s,共30个循环;最后72℃延伸7min,扩增PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测[4]。

表1多杀性巴氏杆菌荚膜分型引物

1.2.7菌株脂多糖多重PCR分型

引物合成参考文献[5],多杀性巴氏杆菌脂多糖外核编码基因簇引物序列见表2。取菌株DNA模板2μL加入到如下50μL反应体系中:10×ExBuffer5μL,dNTP(2.5μmol/L)4μL,上游引物(10μmol/L)各2μL,下游引物(10μmol/L)各2μL,ExTaq酶(5U/μL)0.5μL,补加无菌去离子水至50μL。置于PCR仪中依照下述参数扩增:94℃预变性5min;94℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸60s,共30个循环;最后72℃延伸7min。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

表2多杀性巴氏杆菌脂多糖分型引物

1.2.8多位点序列分型

根据文献[6]建立的禽源多杀性巴氏杆菌RIRDCMLST分型方法,对分离株的7个看家基因:腺苷酸环化酶基因(adk)、酯酶基因(est)、6-磷酸-甘露糖异构酶基因(pmi)、葡萄糖-6磷酸脱氢酶基因(zwf)、苹果酸脱氢酶基因(mdh)、谷氨酸脱氢酶基因(gdh)、磷酸葡萄糖异构酶基因(pgi)进行扩增及测序,引物序列见表3。所获序列经MEGA7.0软件编辑后,提交到RIRDCMLST在线数据库进行比对,获得菌株的序列型。

1.2.9动物回归试验

取菌株马丁肉汤过夜培养物稀释制备菌悬液,肌肉注射78和114日龄SPF鸡,连续观察2d,记录发病和死亡情况,并对死鸡进行细菌分离,按1.2.1～1.2.8进行鉴定。

表3多杀性巴氏杆菌MLST的引物

2、结果与分析

2.1临床症状和剖检变化

发病鸡场病死率约为30%,患病鸡羽毛粗乱、精神沉郁、食欲减退、呼吸困难、腹泻、体温升高,临死前部分鸡出现发绀。随机对20只患病鸡进行剖检,20/20可见心包积有淡黄色液体并混有纤维素;19/20肺脏淤血水肿,可见散在分布的针尖状灰白色坏死点,表面有大量白色渗出物,呈肺炎症状;16/20肝脏肿大,呈棕红色,表面分布针尖大小灰白色、边缘整齐、大小一致的坏死点;20/20十二指肠出血。

2.2菌落形态及培养特性

按照农业行业标准NY/T541-2016,从患病鸡体内分离获得1株纯培养物,命名为G-2株。菌株G-2在TSA培养基上形成边缘圆润整齐,表面光滑,乳白色半透明菌落。革兰染色为阴性球杆菌。

2.316SrDNA鉴定

菌株16SrDNAPCR扩增产物经电泳检测,大小约为1500bp(图1)。将16SrDNA序列提交到http://www.ezbiocloud.net/identify进行比对,结果与多杀性巴氏杆菌杀禽亚种模式菌株NCTC10204的相似性最高,为100.00%;与多杀性巴氏杆菌多杀亚种模式菌株ATCC43137的相似性为99.93;与多杀性巴氏杆菌败血亚种模式菌株NCTC11995的相似性为98.56%。选取相似性大于97%的菌株16SrDNA序列,用Mega7.0构建系统发育树(NJ法),以猫嗜血杆菌ATCC49733为外源,菌株G-2与多杀性巴氏杆菌杀禽亚种NCTC10204在同一分支(图2)。

图1菌株G-216SrDNAPCR产物电泳结果

M.DL2000DNAMaker;1.阴性对照;2.菌株G-2

2.4Biolog鉴定

菌株培养18h后,通过Biolog鉴定仪读取结果,菌株G-2与多杀性巴氏杆菌杀禽亚种具有良好的匹配性,可能性为0.899,相似性为0.722,位距为3.451,鉴定结果为多杀性巴氏杆菌杀禽亚种。

图2菌株G-216SrDNA系统发育树

2.5荚膜分型

菌株G-2扩增出了与阳性对照CVCC390大小一致的片段,约为1044bp(图3),为多杀性巴氏杆菌荚膜A型特异性片段,判定菌株G-2为荚膜A型。

2.6脂多糖多重PCR

菌株G-2扩增出1307bp左右的片段(图4),为脂多糖L1型特异性片段,判定菌株为脂多糖L1型。

图3菌株G-2荚膜分型PCR产物电泳结果

M.DL2000Maker;1.阴性对照;2.阳性对照CVCC390;3.G-2

图4菌株G-2脂多糖多重PCR产物电泳结果

M.DL2000Maker;1.G-2;2.阴性对照

2.7MLST分型

对多杀性巴氏杆菌G-2株分别进行adk、est、pmi、zwf、mdh、gdh和pgi7个看家基因的扩增和测序,将序列在线提交到RIRDCMLST数据库进行比对,得到各个基因的等位基因编号,所有等位基因的编号组成菌株的序列型,结果显示G-2株为ST129型。

2.8动物回归试验

将菌株TSB过夜培养物稀释成不同的浓度,肌肉注射78日龄和114日龄SPF鸡,每个稀释度注射2只,连续观察2d。动物回归试验结果表明:78日龄SPF鸡注射7、10、13、17和20个CFU在1d内引起全部鸡死亡,114日龄SPF鸡注射10、13和17个CFU在2d内引起全部鸡死亡;临床症状表现为羽毛粗乱、精神沉郁、厌食、呼吸困难、腹泻、发热,临死前部分鸡出现发绀。剖检死亡鸡发现心包积液、肺肿病变、肝脏坏死点、十二指肠出血,采集死亡鸡只的肝脏和心血进行分离,获得菌落形态一致的菌株,经鉴定为多杀性巴氏杆菌杀禽亚种。

3、讨论

禽霍乱是由多杀性巴氏杆菌引起的鸡和火鸡等禽类的一种接触性传染病,多为散发,3～4月龄育成鸡、成年鸡易发。禽霍乱造成成鸡的死亡通常发生于产蛋鸡群,其发病率和死亡率高,给养禽业的发展和公共卫生造成严重威胁[7]。为避免经济损失,疫苗预防接种是比较经济安全的方式。同时养禽场应建立必要的饲养管理和卫生防疫制度,特别是在引种时要严格检疫,防止疫病的传入。一旦发生疫情,应及时采取隔离、消毒等防治措施。

本研究对从湖南禽霍乱鸡体内分离到的1株病原菌,通过菌落形态、染色特性、16SrDNA和Biolog鉴定,确认该菌株为多杀性巴氏杆菌杀禽亚种。采用荚膜多重PCR分型、脂多糖多重PCR分型和多位点序列分型对其基因型进行了鉴定,该菌株为荚膜A型、脂多糖L1型、ST129型。这与文献报道的结果一致[8,9,10]。目前我国禽源多杀性巴氏杆菌的荚膜型以A型为主,多位点序列分型以ST129型为主。动物回归试验证实该菌株能引起SPF鸡典型的禽霍乱症状,肌肉注射7CFU活菌可致死78日龄SPF鸡,10CFU活菌可致死114日龄SPF鸡。结合临床症状和剖检变化,可以确诊为禽霍乱。该疫病的准确和快速确诊,可以为后续预防提供技术依据,同时为养殖场制定免疫程序提供参考。

参考文献:

[2]曲志娜,刘焕奇,孙淑芳,等.兽医诊断样品采集､保存与运输技术规范NY/T541-2016[S].北京:中国农业出版社,2016.

[4]曲连东,郭东春,刘家森,等.禽霍乱(禽巴氏杆菌病)诊断技术NY/T563-2016[S].北京:中国农业出版社,2016.

[7]梁圣,赵新新,程安春.禽霍乱新型疫苗的研究进展[J].畜牧兽医学报,2018,49(11):2317-2325.

[8]李伟杰,田野,岂晓鑫,等.禽源多杀性巴氏杆菌多位点序列分型研究[J].中国兽药杂志,2017,51(2):1-6.

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[10]陶娅,王铉皓,李军朝,等.禽源多杀性巴氏杆菌的分离及生物学鉴定[J].中国兽医杂志,2019,55(4):92-94.

李伟杰,祁鑫,田野,岂晓鑫,蒋桃珍.1株致禽霍乱多杀性巴氏杆菌的病原学与分子生物学鉴定[J].畜牧与兽医,2020,52(06):89-93.

基金:国家微生物资源共享服务平台(NIMR-5).