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探讨在登革病毒Ⅱ型入胞过程中膜联蛋白A2的作用

2020-07-15 252 上传者：管理员

摘要：目的探讨膜联蛋白A2在登革病毒Ⅱ型入胞过程中的作用。方法通过敲低ANXA2和S100钙结合蛋白A10(S100A10)表达以及抗体阻断实验验证ANXA2在DENV-2复制周期中的作用，并进一步通过激光共聚焦显微镜观察、免疫共沉淀分析明确ANXA2与DENV-2E蛋白的相互作用。结果DENV-2感染ANXA2和S100A10敲低的细胞中，DENV-2RNA水平显著降低；ANXA2抗体和DENV-2E蛋白抗体可有效抑制DENV-2的入胞效率，细胞内病毒RNA水平显著低于对照组；此外，ANXA2在DENV-2感染细胞中由细胞质募集到细胞膜上，与DENV-2E蛋白有相互作用。结论ANXA2是DENV-2入胞过程中重要的宿主分子，有望为抗DENV-2研究提供新的靶点。

关键词：
入胞
宿主分子
病毒学
登革病毒Ⅱ型
膜联蛋白A2
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登革病毒是引起登革热的重要病原体，登革热广泛流行于热带和亚热带地区，严重危害人类健康，目前尚无特异性治疗手段，疫苗对人群的保护效果亦不理想[1,2]。DENV通过受体介导的吞噬作用完成其入胞过程，目前已鉴定的DENV受体包括但不局限于DC-SIGN、L-SIGN、CD206和CLEC5等分子[3,4,5]。DENV入胞的分子机制尚不完全清楚，研究DENV如何入胞对寻找抗病毒靶点有重要意义[6,7]。膜联蛋白A2属于钙离子依赖的磷脂结合蛋白家族，以单体和异源四聚体两种形式存在，单体主要存在于细胞质中，参与细胞器膜的组装、溶解和修复；异源四聚体主要存在于细胞膜表面，由两分子的ANXA2与两分子的S100钙结合蛋白A10(S100A10）形成[8]。多项研究表明，ANXA2可转运至细胞外膜，作为受体参与人乳头瘤病毒16、人类免疫缺陷病毒、呼吸道合胞病毒的吸附和侵入[9,10]。目前，DENV-2在4个DENV血清型中传播最为广泛，尚无研究报道ANXA2是否在DENV-2入胞过程中发挥作用。鉴于ANXA2及其复合物在多种病毒入胞过程中的关键作用，本研究拟观察ANXA2在DENV-2感染细胞后的细胞内定位并探究ANXA2功能抑制后对DENV-2入胞的影响，为DENV-2感染的分子机制和抗DENV-2靶点的筛选提供实验依据。

1、材料与方法

1.1材料

DMEM和RPMI-1640培养基、0.25%胰蛋白酶均购自美国赛默飞公司，胎牛血清购自杭州四季青有限公司，JetPrime转染试剂购自法国Polyplus-transfection公司，总RNA抽提试剂盒购自美国Omega公司，反转录试剂盒和SYBRGREENⅡ两步法实时荧光定量PCR试剂盒购自大连宝生物公司，兔抗ANXA2多克隆抗体、兔抗S100A10多克隆抗体、鼠IgG抗体、兔抗HA标签单克隆抗体、488标记羊抗兔多克隆抗体和羊抗鼠Cy3标记多克隆抗体均购自生工生物工程（上海）股份有限公司，鼠抗DENVE蛋白抗体购自美国GeneTex公司。shRNA引物（见表1）、实时荧光定量多聚核苷酸链式反应（real-timequantitativepolymerasechainreaction,RT-qPCR）引物（见表2）和PCR引物（见表3）均由北京擎科新业生物技术有限公司合成。

表1shRNA序列

表2RT-qPCR引物

表3PCR引物

1.2细胞培养与DENV-2扩增

Huh-7细胞和293T细胞用含10%血清的DMEM培养基置于37℃、5%CO2孵箱中培养，C6/36细胞用含10%血清的RPMI-1640培养基置于28℃、5%CO2孵箱中培养。

DENV-2由C6/36细胞扩增。DENV-2[感染复数（multiplicityofinfection,MOI)=0.01]感染C6/36细胞2h后，换含2%血清的RPMI-1640培养基继续培养6～8d，细胞出现明显病变后，收集培养上清，10000rpm4℃离心15min，去除细胞碎片，上清分装后于-80℃冰箱保存。

1.3shRNA转染

针对ANXA2和S100A10基因，每个基因设计3对shRNA引物（#1,#2,#3）。将shRNA引物（见表1）通过同源重组方式退火进入pLKO.1载体并测序确认，构建转录shRNA的质粒。Huh-7细胞以2×105cell/ml接种6孔板，按照JetPrime试剂盒说明书分别转染shANXA2、shS100A10和阴性对照（shNC),72h后0.25%胰蛋白酶消化转染细胞后铺2组6孔板。一组提RNA,RT-qPCR检测shRNA抑制效率，另一组以DENV-2(MOI=1）感染，感染2h后换10%DMEM培养基，期间每隔15min晃动培养板使DENV-2充分吸附。感染后24h,PBS洗3次彻底去除上清中病毒RNA，然后提取总RNA,RT-qPCR检测细胞内病毒RNA水平。

1.4RT-qPCR

所有样本总RNA用美国Omega公司RNA提取试剂盒提取，RNA定量后用TaKaRa反转录试剂盒反转录1μgRNA为cDNA，用TaKaRaSYBRGREENⅡ实时荧光定量PCR试剂盒扩增目的基因片段和内参基因β-actin片段，其中NS5为DENV-2RNA片段引物（见表2）。

1.5抗体阻断实验

Huh-7细胞以2×104个/孔铺12孔板，24h后DENV-2(MOI=1）分别与ANXA2抗体、S100A10抗体、DENV-2E蛋白抗体、鼠IgG抗体加入Huh-7细胞中共孵育2h,PBS洗3次后，加10%DMEM培养基于37℃、5%CO2孵箱中继续培养12h。PBS洗3次去除上清中病毒RNA，提取总RNA，检测DENV-2RNA水平。

1.6激光共聚焦显微镜分析ANXA2与DENV-2共定位

Huh-7细胞以5×103个/孔爬片，24h后DENV-2(MOI=5）感染Huh-7细胞，置于37℃孵箱中孵育2h，每15min晃动培养板使DENV-2充分吸附。2h后用PBS洗爬片5次，用4%的多聚甲醛固定10min后PBS洗2次，0.5%TritonX-100作用10min后PBS洗2次。3%牛血清白蛋白室温封闭1h后，PBS洗3次。用3%BSA1∶300稀释一抗（兔抗ANXA2多克隆抗体，鼠抗DENVE蛋白抗体），4℃过夜孵育。第2dPBS洗4次后，3%BSA1∶200稀释对应二抗（488标记羊抗兔多克隆抗体，羊抗鼠Cy3标记多克隆抗体），室温孵育1h后PBS洗5次。4',6-二脒基-2-苯基吲哚染核，50%甘油封片，激光共聚焦显微镜下观察。

1.7载体构建

从细胞总cDNA中扩增ANXA2和S100A10基因片段，克隆进pCAGGS-HA(C末端）载体中，分别构建pCAGGS-ANXA2-HA和pCAGGS-S100A10-HA（引物见表3）。

1.8免疫共沉淀实验

分别将pCAGGS-ANXA2-HA和pCAGGS-S100A10-HA质粒转染293T细胞，48h后以DENV-2(MOI=1）感染。感染后24h收集细胞，裂解后将裂解上清与HA磁珠在4℃孵育过夜，充分洗涤磁珠后煮沸10min，离心并收集上清，蛋白免疫印迹法检测蛋白水平，兔抗HA标签单克隆抗体检测ANXA2和S100A10蛋白水平，鼠抗DENVE蛋白抗体检测DENV-2E蛋白水平。

1.9统计学处理

采用GraphPadPrism6.0软件对实验数据进行统计学分析，统计方法为独立样本t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1ANXA2和S100A10低表达影响DENV-2感染

基因敲低实验结果显示，3对针对ANXA2的shRNA中，与对照组相比，1号shRNA可抑制63.6%ANXA2mRNA表达（t=6.222,P=0.003),2号shRNA可抑制77.8%ANXA2mRNA表达（t=7.671,P=0.002),3号shRNA无抑制效果（t=0.037,P=0.972）（见图1A);3对针对S100A10的shRNA中，与对照组相比，1号shRNA无抑制效果（t=2.096,P=0.104),2号shRNA可抑制85.1%S100A10mRNA表达（t=6.382,P=0.003),3号shRNA可抑制41.4%S100A10mRNA表达（t=2.842,P=0.047）（见图1B);ANXA2敲低的细胞中，DENV-2RNA水平为对照组的14.2%(t=14.860,P=0.000),S100A10敲低的细胞中，DENV-2RNA水平为对照组的44.7%(t=6.881,P=0.002）（见图1C）。

图1ANXA2和S100A10低表达细胞中DENV-2RNA的复制水平

A.对ANXA2基因的抑制效率；B.对S100A10基因的抑制效率；C.选择抑制效率更好的ANXA2#和S100A10#2检测DENV-2RNA水平；*.P<0.05;**.P<0.01;***.P<0.001

2.2ANXA2抗体可有效阻断DENV-2感染Huh-7细胞

抗体阻断实验结果显示，与正常对照组相比，鼠IgG抗体不影响DENV-2感染，DENV-2E蛋白抗体处理组中DENV-2RNA水平降低96.7%(t=38.910,P=0.000),S100A10抗体处理组中DENV-2RNA水平降低25.8%(t=6.982,P=0.020),ANXA2抗体处理组中DENV-2RNA水平降低56.7%(t=17.100,P=0.003）（见图2）。

2.3ANXA2与DENV-2E蛋白在病毒入胞阶段的共定位分析

激光共聚焦显微镜结果显示，未感染组细胞中DENV-2E蛋白无染色，ANXA2均匀分布在细胞中；DENV-2感染组细胞中，ANXA2在细胞膜区域有明显聚集，与点状DENV-2E蛋白染色有共定位（见图3）。

图2不同抗体抑制DENV-2入胞实验中RNA的相对水平

CTRL.正常对照组（不加任何抗体）；anti-E.DENV-2E蛋白抗体；anti-S100A10.S100A10抗体；anti-ANXA2.ANXA2抗体；*.P<0.05;**.P<0.01;***.P<0.001

2.4ANXA2、S100A10与DENV-2E蛋白相互作用

免疫共沉淀结果显示，空载体与DENV-2E蛋白无相互作用，带HA标签的ANXA2和S100A10均与DENV-2E蛋白存在相互作用（见图4）。

3、讨论

关于DENV入胞机制研究一直广受重视，目前已有研究报道与DENV入胞相关的多种受体和辅受体[3,11,12]。这些受体和辅受体，从功能上可大致分为两类：一类是氨基聚糖类，如带高电荷的硫酸乙酰肝素、神经酰胺等，可以作为受体与所有血清型DENV结合，是吸附病毒的始动因子，起到聚集病毒颗粒的作用；另一类是分子量大小不同的蛋白质，如热休克蛋白、GRP78、LAMR1、DC-SIGN等，这类分子在不同血清型、病毒株侵入靶细胞过程中具有特异性。综合这些研究结果可以发现，DENV-2与受体结合步骤多且过程复杂，涉及不同的病毒吸附蛋白及多个靶细胞受体，鉴定新的DENV-2受体和辅受体有助于理解DENV-2入胞机制。本文探讨了ANXA2在DENV-2入胞过程中的作用，通过一系列实验明确了ANXA2功能异常可显著影响DENV-2的入胞效率，为DENV-2入胞机制研究提供了更多实验依据。

ANXA2是一种重要的钙离子依赖性磷脂结合蛋白，分子量约为38kDa，参与细胞的多种生理生化活动，如胞膜运动、囊泡运输、胞吞和胞吐作用等。在细胞受到刺激后，ANXA2从细胞质转移到细胞膜，与S100A10形成异源四聚体[10]。本研究通过激光共聚焦显微镜观察到DENV-2吸附至Huh-7细胞的过程中，可诱导细胞质内分布的ANXA2募集到细胞膜上，并且与DENV-2E蛋白共定位，而S100A10是否在此过程中起作用还需继续研究；免疫共沉淀实验进一步明确了DENV-2E蛋白与ANXA2和S100A10的相互作用。在之前的研究报道中，ANXA2参与了HPV-16和巨细胞病毒的内吞过程，并且可增强病毒感染[13,14]。HPV-16在人角质形成细胞中诱导ANXA2转移到细胞膜外，从而作为受体分子结合HPV-16并介导病毒内吞；在人巨细胞病毒感染过程中，病毒与ANXA2结合并增强了人巨细胞病毒的感染[15]。此外，还有研究发现，在感染HBV后的细胞中，细胞膜上ANXA2水平逐渐下降，可有效防止HBV的过度感染[16]。另有研究观察到ANXA2在人胚横纹肌瘤细胞表面的表达增强了EV71型的感染[17]。

图3ANXA2与DENV-2E蛋白在病毒入胞阶段的共定位分析

图4ANXA2、S100A10与DENV-2E蛋白在细胞内的相互作用

Input组.HA抗体检测ANXA2和S100A10表达情况；IP组.DENV-2E蛋白抗体检测带HA标签的ANXA2和S100A10分别与DENV-2E蛋白的相互作用情况；Vetocr.空载体；α-HA.HA抗体；α-Envelope.DENV-2E蛋白抗体

本研究中，低表达S100A10和ANXA2的细胞中，DENV-2RNA的复制水平降低，提示S100A10和ANXA2对DENV-2的复制周期有显著影响。抗体阻断实验中，以DENV-2E蛋白抗体作为阳性对照、鼠IgG抗体作为阴性对照，ANXA2抗体可显著抑制进入细胞的DENV-2，表明ANXA2在DENV-2入胞阶段参与DENV-2的复制周期，是DENV-2感染起始过程中的重要宿主因子之一。因此，ANXA2在多种病毒包括DENV-2感染细胞的入胞过程中均起到重要的促进作用。除了参与病毒的入胞阶段，ANXA2在HCV致病机制中也起着重要作用，可将病毒NS3/NS4A募集到脂筏微结构域，从而在Huh7.5细胞中启动病毒复制复合物[18]。DENV-2与HCV具有相似的复制机制，ANXA2是否在DENV-2入胞后的复制阶段调控病毒的翻译和转录尚未见报道。此外，ANXA2促进DENV-2入胞是以单体形式还是与S100A10形成四聚体形式发挥功能还须深入研究。

综上所述，我们的研究发现ANXA2可能是DENV-2感染的辅受体之一，通过结合DENV-2E蛋白在DENV-2入胞过程中起到重要作用，为进一步揭示DENV-2入胞的分子机制打下基础，拓展了对DENV-2复制周期的了解，为抗病毒药物靶点的研究提供实验依据。

傅晗,冯哲斌,李硕,叶伟,雷迎峰,张芳琳,徐志凯,董阳超.膜联蛋白A2在登革病毒Ⅱ型入胞过程中作用的初步研究[J].传染病信息,2020,33(03):207-211.

基金:国家自然科学基金青年基金项目(81702003);陕西省重点研发计划一般项目(2020SF-207).