流感是一种病毒性急性呼吸道传染病,每年都发生季节性流行,偶尔暴发大流行。流感病毒具有高度变异性,持续开展监测是防控流感的有效手段,而从临床样本中分离流感病毒的能力对于流感监测至关重要。马丁-达比犬肾细胞(Madin-Darbycaninekidney,MDCK)是由Madin和Darby从正常雄性英国小猎犬肾中建立的细胞系。使用贴壁MDCK细胞分离流感病毒因敏感度好、效率高,是实验室最常用的方法,但此方法技术要求较高,容易受到各种因素的影响。在2016年全球流感监测与应对网络(GlobalInfluenzaSurveillanceandResponseSystem,GISRS)对亚太地区流感中心流感病毒细胞分离鉴定实验进行的室间质量评价中,只有6/21个实验室获得了所有(15/15)考核样本的正确结果[1],突出了提高流感病毒细胞分离能力的迫切问题。本文就影响贴壁MDCK细胞分离流感病毒因素方面的一些研究作一综述。

1、细胞培养

1.1 细胞株选择

相比BHK-21、LLC-MK2、MEK和Vero等细胞,MDCK细胞已被证明更敏感、更可靠[2,3],但与人类呼吸道细胞不同,MDCK细胞上的α-2,6唾液酸受体相对较低,而不同的MDCK细胞株间因其表面受体识别的不同,对流感病毒的敏感性也会不同。从2015年开始,H3N2流感病毒以3C.2a分支进化为主[4,5],使得病毒分离率普遍降低[6]。MDCK-Siat1和MDCK-London是传统MDCK细胞经修饰后用以表达更高水平的α-2,6唾液酸受体的细胞株,比传统MDCK细胞分离流感病毒更有效,基因序列变化也更少,特别是对于H3N2流感病毒3C.2a进化枝效果更明显[7,8]。Lugovtsev等[9]从传统的MDCK细胞克隆得到的1、2和3型细胞株,它们在形态、碳水化合物表达和对流感病毒的复制特性方面均有所不同。实验室可根据当地流行的流感毒株类型,选择更敏感的细胞株。

1.2 细胞传代

在MDCK细胞的对数生长期,即观察到细胞生长至接近汇合或刚好汇合时进行传代,可保持细胞良好的生长特性。传代时细胞密度过稀或过密均有可能影响细胞表形,降低细胞敏感性,并且这些变化可能无法逆转。细胞密度过低时,不仅会因细胞之间的信号交流缺失,释放的可扩散性信号、调控因子等代谢产物不足,导致细胞增殖缓慢,状态变差;同时容易引起细胞局部生长过密;细胞长至汇合后,若不及时传代,细胞会出现密度抑制而脱离生长周期,细胞将逐渐死亡,再传代效率低下。不健康的MDCK细胞常常呈颗粒状,核周有空泡,边缘不清晰。

1.3 细胞代次

随着时间的推移,培养的细胞不可避免地发生形态、生长和遗传特征等的变化,MDCK细胞通常在总传代数达40～50代后开始衰老。传代次数的增加会降低MDCK细胞对流感病毒的易感性[10]。因此,实验室应尽量多冻存低代次的细胞。杨慧萍等[11]认为,如果细胞生长状态良好,较高代次(P45、P143)的MDCK细胞对流感病毒分离结果无影响。建议在使用较高代次(>40代)的MDCK细胞前先用已知滴度的阳性毒株测试细胞的敏感性,再考虑是否使用。

1.4 细胞温度

MDCK细胞在36～37℃生长较好,对低温的耐受范围较大,但对高温很敏感,若温度≥40℃,细胞很容易死亡。因此,为防止高温损伤,培养温度一般稍低于37℃,并要随时监控培养温度。适当降低培养温度可使细胞生长周期变长,有时可用于调整工作时间。

1.5 细胞消化

MDCK细胞传代时一般用0.25%EDTA-胰酶37℃消化3～5分钟,生长较密的细胞可能需要延长消化时间,细胞一旦相互分离并变圆和透亮,应马上停止消化,过度消化的细胞很难恢复到原有的状态。MDCK细胞对机械力也比较敏感,若消化时间不足,通过振摇培养瓶或强制将细胞吹打下来,则容易损伤细胞和导致细胞聚团生长。在细胞消化的整个过程还要注意避免产生气泡,因为气泡破裂时会产生强大的机械剪力。

1.6 细胞培养基

一般包含葡萄糖、氨基酸、维生素、平衡盐溶液和血清等组分。葡萄糖通过糖酵解途径中的丙酮酸分解提供大部分的细胞能量,而谷氨酰胺是蛋白质和肽成分生物合成的重要组成部分。提高葡萄糖和谷氨酰胺含量能使MDCK细胞增殖活跃,但需注意及时更换培养液以减少葡萄糖的代谢产物如乳酸的积累及pH值下降带来的负面影响。谷氨酰胺容易在培养基中分解并产生细胞毒性氨,在使用培养基前最好再加入谷氨酰胺,或者使用防止降解的丙氨酰谷氨酰胺或甘氨酰谷氨酰胺。缓冲剂4-羟乙基哌嗪乙磺酸(2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonicacid,HEPES)具有很强的缓冲能力,尤其是在CO2环境中,HEPES比碳酸氢盐的pH值更加稳定,但它暴露于可见光时会产生高水平的细胞毒性产物如过氧化氢,含HEPES的培养基应注意避光。血清中包含许多动物细胞生长所必需的活性物质,可促进细胞生长和贴壁,这使得含血清的培养基易于设计,适用性强。常用的血清有胎牛血清(fetalcalfcerum,FBS)、小牛血清和马血清。FBS通常富含生长因子,并含有较低水平的γ-球蛋白(能抑制细胞生长),是目前使用最广泛的血清。培养基中加入FBS的浓度范围一般在5%～10%,提高浓度可加快细胞增殖速度[12],有时可通过调节使用浓度改变细胞的增殖速度以方便工作安排,但浓度过高会产生细胞毒性,反而抑制了细胞增殖[13]。不同厂家、批次的FBS与细胞株的耐受程度不同,在使用前最好测试最佳浓度范围。FBS解冻时,若温差太大(如-20～37℃),容易产生沉淀物,这有别于很多冻存试剂(胰酶、抗生素等)的解冻方式。-20℃的FBS取出后,应先置4℃过夜再置室温逐步解冻,如果时间不允许,至少也要在室温下放置约10min,再置37℃的水浴中解冻。FBS解冻后应及时移出,以减少在37℃水浴中暴露的时间。高于37℃解冻血清,可能会导致血清关键成分的降解。血清来源于动物,成分复杂,每批产品可能都不尽相同,这不仅使培养结果的再现性降低,增加培养基污染的风险,还可能导致传代过程中细胞培养基条件的改变。Nelson等[14]发现培养基条件的变化会改变MDCK细胞表面唾液酸受体的分布,影响流感病毒的分离。使用无血清的培养基或可避免这些问题,但无血清培养基需添加的组分较多,设计困难。现今已有很多商业化的无血清培养基,在使用前应验证其和本实验室所用细胞的适应性。

1.7 试剂预热

4℃冰箱中保存的试剂,使用前在37℃水浴箱中预热是比较常见的做法。不过,目前并没有证据能证明4℃试剂不预热而直接使用会对贴壁MDCK细胞产生影响。MDCK细胞生长在贴壁状态时,对低温比较耐受,郑勤妮等[15]的研究表明,MDCK细胞4℃保存6天内对B型流感病毒的分离和增值无影响。4℃冷藏的试剂建议在实验前取出后室温放置即可,不需解冻,如此不但简化了步骤,而且能减少预热步骤的污染风险。需要注意的是,当细胞在非贴壁状态如复苏、消化时,生命力特别脆弱,此时预热试剂更有利于细胞生长状态的恢复,可避免温度差异对细胞造成损伤,减少细胞死亡。含生物活性的胰酶、血清以及含谷氨酰胺的培养液应避免反复37℃加热,以免试剂分解、失活。

2、病毒培养

2.1 病毒接种量

接种量对最终产毒量影响较大。接种量过少,病毒感染数偏少,复制效率低产毒不足;接种量过多,病毒复制时除了生成全长基因病毒外,还会生成一些严重截短基因的病毒(缺陷病毒或不完全病毒),干扰正常病毒的复制,反而会降低血凝(haemagglutination,HA)滴度。周大宇等[16]的研究显示,随着接种量的增加,流感病毒的HA滴度均呈现先升高后降低的趋势。有研究[17,18]表明最佳的感染复数(multiplicityofinfection,MOI)为0.01,刚好长满的单层细胞数能够估算出来,样本(或2代接种物)中的病毒数虽无法获知,但是否可根据同样本的其它检测结果(如PCR实验的CT值或HA试验的滴度)估算病毒数的大小并适当调整病毒接种量,值得进一步研究。

2.2 病毒吸附时间

使用吸附法分离流感病毒时,一般要吸附1～2h。吸附时间太短病毒不能有效感染细胞,太长则容易产生细胞毒作用。虽有研究[19]认为吸附时间在1～2h之间HA滴度无明显变化,但多数研究显示,病毒吸附时间和温度有关,温度越高吸附时间越短,在34℃、35℃吸附1.5～2h[18,20],36℃吸附1～1.5h[16],37℃吸附1h[20],测得的HA滴度较高。因为吸附时加入的液体一般都比较少,其pH值、营养条件等变化较快,选择较高的吸附温度以减少吸附时间,可能会降低吸附过程对MDCK细胞的影响。

2.3 病毒培养时间

病毒接种后,当75%～100%细胞出现病变时收集病毒液,如果收集不及时而继续培养则容易生成缺陷病毒[21],降低HA滴度。病毒培养时间一般在72～96h[17,18,22],甲型H1N1流感病毒因复制速度较快培养时间相对较短(48～60h)[23],而乙型流感病毒因感染细胞释放子代病毒的过程要慢于甲型流感病毒,一般可适当延长培养时间。

2.4 病毒培养温度

大多数流感病毒在35℃生长良好,但禽流感病毒在37℃,一些乙型流感病毒在33℃生长则更为合适。毒株、培养基等实验条件的差异可能会有不同的培养温度,席莉等[18]认为最适温度为34℃,而余钧池等[22]认为35.5℃温度最佳。可根据自身实验条件测试合适的培养温度。

2.5 病毒传代数

流感病毒第1代培养阴性的样本,继续盲传可提高分离率,盲传2～3代HA滴度能显著提高,但随着传代次数的增加滴度反而下降甚至消失[16,24],这可能与子代病毒对细胞的敏感性降低有关。另外,为适应传代条件的压力,增加传代数不仅会增加病毒基因变异的风险[25],而且会累积传代信号,影响病毒的进化模式[26]。因此,只要鉴定结果(如HA滴度)达到工作需求,就不应盲目传代,以保证分离的病毒株和原始病毒的一致性。

2.6 TPCK胰酶

流感病毒HA不能直接凝集红细胞,但能被TPCK处理的胰酶切割为HA1和HA2,从而具备了感染性。胰酶对细胞有消化作用,易造成细胞脱壁,不同细胞株对胰酶的耐受程度可能存在着差异,在每次复苏新细胞后应进行TPCK胰酶浓度滴定。TPCK胰酶通常用量为2μg/ml,也有研究[22]认为增加胰酶用量(2.5～5μg/ml)可明显提高病毒的HA效价。流感乙型及季节性H3N2加入胰酶的浓度可稍高于甲型H1N1[27,28]。

2.7 FBS和BSA

FBS不但能丧失胰酶分解蛋白的作用,其含有的一些物质还能覆盖细胞膜上的病毒受体,降低病毒感染力[29],相关研究[30]显示加入FBS的浓度越高则病毒的HA效价越低。因此,在接种流感病毒前应充分洗涤细胞单层,以确保去除任何血清残留。病毒培养液中一般要加入牛血清白蛋白(albuminfrombovineserum,BSA),以维持细胞的正常代谢功能。应注意的是,BSA可能会影响甲型H1N1的分离率,浓度越高时病毒滴度越低[10,23]。因此,在病毒培养液中加入BSA一定要慎重,尽量保持低浓度。

3、样本保存

流感病毒对高温敏感,样本的保存条件对病毒的存活至关重要。尽可能缩短采样至接种的时间是提高流感病毒分离阳性率的关键[31,32]。样本可在0～4℃暂存,建议不要超过48h,研究[33]显示样本保存48h后流感病毒分离的阳性率是48h内的0.371倍。超过48h的样本一般要求置于-70℃以下条件保存,即使如此,病毒分离的阳性率仍然低于48h内检测的样本[34],这可能是因为样本冷冻后损失了一些病毒生存力,且随着保存时间的增加,生存力进一步降低。应避免反复冻融样本,因为每次冻融都会降低流感病毒的生存力[35]。建议将样本分装后再冻存,以减少不必要的冻融。

4、防止污染

污染可能发生在分离培养病毒过程中的每个环节,发生污染不仅耗时耗力,更可能导致错误结果,是影响实验成败的关键因素。如何发现(目测、检测)污染已有很多报道[36,37],污染一旦确认,最理想的做法是,立即丢弃被污染的培养物,继续保留会增加其它培养物和操作环境污染的风险。实验人员对于显性污染(如细菌、真菌污染严重时)一般能很快识别并采取措施,但隐性污染(如支原体、细胞交叉污染)则由于难以察觉,往往影响深远,而世界上的支原体污染率普遍较高,从15%到80%不等,有些甚至达到100%[38]。因此,重要的是提高无菌操作技术,防止污染。细胞培养的无菌技术也多有报道[39,40],但有几点是实验人员比较容易忽略的:①实验前务必擦洗手和手臂至少2min。因为人类皮肤中天然存在很多细菌、真菌,洗手能大幅减少附着的微生物,并带走干皮屑。②工作中戴的手套,应经常擦拭消毒或者更换。③尽量减少容器敞口的时间,移液时尽可能斜放着操作,不要让手或其它物品经过已开口的容器上方。④打开瓶盖时最好用手指夹住而不让它触碰任何物体,也不宜将瓶盖口朝上放置在台面。⑤使用水浴箱解冻溶液时,应避免水位上升到瓶盖位置。⑥碘酊穿透力比乙醇强,有时采用2.5%碘酊代替75%乙醇消毒物体表面效果更好。⑦慎重使用抗生素。抗生素虽能有效抑制细菌和真菌的污染,但也存在许多问题,如可能产生细胞毒性(两性霉素B);长期使用产生耐药性;不能彻底杀菌而导致隐性污染等,一些经验丰富的实验人员在细胞培养过程并未使用抗生素。

目前对于贴壁MDCK细胞分离流感病毒的影响因素已有很多研究,有些研究结果并不一致,这除了和实验条件有关外,研究的样本量偏少也可能是原因之一。未来扩大研究的样本量并纳入更多的影响因素研究,如培养基的渗透压和保存时间、操作过程中产生机械应力或刺激、环境气相差异以及HA试验所用的血球类型等,以找出更多的影响规律,优化实验条件,提高贴壁MDCK细胞分离流感病毒的效率和质量。

参考文献：

[4]梁丽君,倪汉忠,张欣.2011-2015年广东省H3N2亚型流感病毒血凝素基因变异和进化[C]//广东省预防医学会医学病毒学专业委员会.2016新发传染病研究热点研讨会论文集.广州,2016.

[5]鄢翠林,崔大伟.2016-2017年我国甲型流感病毒H3N2亚型HA和NA基因的分子特征分析[J].临床检验杂志,2018,36(1):66-69.

[6]曹蓝,鲁恩洁,李魁彪,等.2017年广州市16株H3N2流感病毒耐药基因分子特征分析[J].现代预防医学,2019,45(9):1693-1697.

[10]冯婷,殷仲伟,李晋蓉,等.流感病毒H1N1在MDCK细胞的培养及纯化条件的优化[J].中国病原生物学杂志,2012,7(7):493-496.

[11]杨慧萍,刘李,马小珍,等.不同代次MDCK细胞对流感病毒的敏感性比较[J].预防医学情报杂志,2012,28(11):890-892.

[12]杜溪乔,任莉娜,王宇,等.MDCK细胞生长液优化配方的研究[J].中国卫生检验杂志,2013,23(4):860-861.

[13]马萍,梦瑶,李欣玥,等.狗肾细胞培养条件优化[J].现代预防医学,2017,44(18):3379-3384.

[15]郑勤妮,万永虎,庄丽,等.应用4℃冰箱分离B型流感病毒[J].中国基层医药,2015,22(11):1623-1626.

[16]周大宇,李春,赵晓辉,等.流感病毒在MDCK细胞上培养条件的优化分析[J].现代预防医学,2015,42(18):3368-3370.

[18]席莉,刘旭光,李爽,等.甲型流感病毒在贴壁MDCK细胞上增殖条件的优化[J].中国生物制品学杂志,2018,31(10):1061-1065.

[19]赵晓辉,周大宇.甲型流感病毒在MDCK细胞上培养条件的优化[J].卫生研究,2014,43(2):210-212,218.

[20]张俊君,张燕丽,秦龙,等.利用狗肾传代细胞分离流感病毒及分离条件的研究[J].实用医学杂志,2014,30(5):687-690.

[22]余钧池,陈柳军.流感病毒在MDCK细胞中培养的条件优化[J].国际检验医学杂志,2014,35(1):92-94.

[23]夏瑜,詹亚惠,韩卫宁,等.甲型H1N1流感病毒制备方法的优化[J].中国卫生检验杂志,2013,23(13):2837-2839.

[24]赵晓辉,周大宇.甲型流感病毒在MDCK细胞上培养条件的优化[J].卫生研究,2014,43(2):210-212.

[27]慕毓.流感病毒细胞培养时胰酶添加量的优化分析[J].中国城乡企业卫生,2016,31(6):63-64.

[28]李贝贝,罗剑,黄海武,等.流感疫苗病毒株在MDCK细胞中的培养条件[J].国际生物制品学杂志,2018,41(6):261-265.

[29]殷震,刘景华.动物病毒学[M].北京:科学出版社,1997:215-218.

[30]陈润莉,周海涛,侯红斌,等.流感病毒在MDCK细胞上的培养条件优化[J].实用预防医学,2011,18(7):1203-1205.

[31]马萍,许晶,张蕾,等.流感病毒细胞培养阳性相关影响因素分析[J].中国卫生检验杂志,2016,26(13):1869-1871.

[32]韩志国,薛娜,樊旭成,等.流行性感冒病毒细胞培养阳性相关影响因素分析[J].微生物学免疫学进展,2018,46(2):48-51.

[33]胡青坡,宋海红.病例选择和标本保存对流感病毒分离率的影响[J].中国热带医学,2012,12(3):338-339.

[36]陈琳,陈鲤群.细胞污染及检测鉴定[J].中国细胞生物学学报,2017,39(4):496-503.

[39]周梦怡,勇强,徐莉.细胞培养无菌技术及有效控制污染的措施[J].实验与检验医学,2016,34(4):477-479.

[40]马艳南,阎雪莹,殷悦,等.细胞培养技术及避免污染的方法[J].黑龙江科技信息,2014,18(29):108-109.

陈家图,李晓君,许铭清,罗雪梅,廖国东.贴壁MDCK细胞分离流感病毒影响因素研究进展[J].医学动物防制,2020,36(10):948-952.

基金:2018年中央重大公共卫生服务重大传染病项目(2100409).