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嵌合型PCV1-3感染性克隆的构建及病毒拯救

2023-10-18 37 上传者：管理员

摘要：为了构建猪圆环病毒1型(porcine circovirus type 1, PCV1)和猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3, PCV3)的嵌合病毒PCV1-3,并为PCV3疫苗研制奠定基础，该研究以PCV1基因组为骨架，将PCV1的ORF2基因替换为PCV3的ORF2基因，构建嵌合型猪圆环病毒(PCV1-3)DNA克隆。PCR和序列测序结果显示，成功构建出了PCV1-3感染性克隆；将感染性克隆转染PK-15细胞，并将第4代病毒进行免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)和蛋白免疫印迹(Western Blot)检测，结果显示成功拯救了重组病毒PCV1-3。对第4代病毒进行滴度测定，效价为105.13TCID50/mL。因此，该试验成功拯救出一种新型嵌合型病毒PCV1-3,并为进一步研究PCV3疫苗奠定了基础。

关键词：
PCV1
PCV3
嵌合型病毒
感染性克隆
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猪圆环病毒(porcine circovirus, PCV)是一种很小的无囊膜单股环状动物病毒，归属于圆环病毒科[1,2]。在2016年之前猪圆环病毒只有2种血清型，即PCV1与PCV2。PCV1无致病性，但能够感染PK15细胞。PCV2是致病性的病毒，是断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)的主要病原[3,4]。2016年，美国学者发现了一种新型猪圆环病毒，命名为PCV3[5]。PCV3的感染可引起猪的多种疾病，如母猪的繁殖障碍、多系统炎症、免疫力下降甚至引起免疫抑制等[6]。目前，PCV3的感染在世界范围内均有流行，对养猪业产生了巨大影响，虽然市场上PCV2商品化疫苗有10余种[7],但国内外还没有商品化的PCV3疫苗。而PCV2与PCV3编码诱导中和抗体的衣壳蛋白Cap基因组的同源性仅有30%左右，传统的PCV2疫苗几乎不能提供交叉保护[8]。因此，研发成本低、保护效力高的PCV3疫苗很有必要。

PCV3与PCV1的同源性仅有40%左右，但其基因组大小和组成非常相似，都具有2个主要的开放阅读框(open reading frame, ORF),其中ORF2均编码病毒衣壳蛋白，但2种病毒的衣壳蛋白之间没有抗原交叉性。由于PCV3分离培养较为困难，体外表达抗原成为疫苗制备的首选[9]。

目前，已有文献报道重组嵌合型PCV1-2是预防PCV2引起疾病的良好疫苗，其制备过程为本研究提供良好的思路[10,11]。鉴于此，本研究以PCV1的全基因组作为骨架，将其ORF2基因替换成PCV3的ORF2基因，利用PCV1的复制能力和PCV3 Cap蛋白的免疫原性，为研究低成本、高效保护力的PCV3疫苗奠定良好的基础。

1、材料与方法

1.1 细胞、质粒与载体

无PCV污染的PK-15细胞系、PCI表达载体由青岛农业大学动物医学院实验室保存，pEASY-Blunt zero-PCV3质粒、PMD18-T-PCV1质粒也由本实验室构建。

1.2 主要试剂

DL2000 DNA Marker、Prime STAR Max购自宝生物工程(大连)有限公司。DNA纯化回收试剂盒购自北京OMEGA有限公司。质粒小提试剂盒购自康宁生命科学有限公司。转染试剂Lipofectamine 3000 Transfection Kit购自Invitrogen公司。PCV3 ORF2单克隆抗体由郑州大学实验室馈赠。ACE底物显色液购自北京Solarbio公司。HRP-SPA购自abcam公司。

1.3 引物设计与合成

根据PCV1(AY193712.1)、PCV3(MG947596.1)全基因组序列设计4对引物(见表1),其中F1、R1与F3、R3用于PCV1缺失ORF2基因组扩增，F2、R2用于PCV3 ORF2基因组扩增，在设计引物时添加了重叠部分序列。F4、R4用于检测嵌合病毒PCV1-3基因组部分片段。

表1 引物名称及序列

1.4 PCV1-3DNA克隆的构建

以重组质粒PMD18-T-PCV1和pEASY-Blunt zero-PCV3为模板，分别建立50 μL普通PCR反应体系：Prime STAR Max: 25 μL,上游引物2 μL,下游引物2 μL,模板2 μL,加ddH2O补齐50 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性4 min; 94 ℃变性30 s, 58 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 35个循环；72 ℃ 终延伸7 min。反应结束经1.0%琼脂糖凝胶电泳并回收。对回收产物PCV1 ORF2与PCV3 ORF2片段进行重叠PCR,反应结束经1.0%琼脂糖凝胶电泳并回收。采用双酶切Nhe Ⅰ和Not Ⅰ将PCI载体线性化，采用无缝连接的方法将上述DNA线性序列与线性载体序列冰上配制反应体系(表2)。37 ℃反应30 min后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，进行PCR与测序鉴定。

表2 配制体系

1.5 嵌合病毒PCV1-3的拯救

1.5.1 DNA的转染

使用6孔细胞培养板培养无PCV污染的PK-15细胞，待其生长至75%左右时，按照转染试剂说明书将PCV1-3转染至PK-15细胞中。72 h后收集转染后的细胞，反复冻融3次后，用滤器将细胞碎片滤除，所得滤液接种于新的PK-15细胞中，依次盲传5代。

1.5.2 PCR检测

转染细胞经5次传代后将细胞悬液提取总DNA,用引物F4、R4进行PCR扩增鉴定，步骤参照1.4,同时设正常PK-15细胞作为阴性对照。

1.5.3 免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)检测

应用PCV3 ORF2单克隆抗体通过免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)检测PCV3衣壳蛋白的表达，确认PCV1-3 DNA克隆在转染细胞中的感染性。将转染72 h后的细胞使用PBS洗涤3次，放入37 ℃温箱中干燥50 min后放入-20 ℃冰箱中冷冻50 min, 拿出后使用4%预冷的多聚甲醛固定液在4 ℃固定45 min, 用PCV3 ORF2单克隆抗体(1∶150)在37 ℃恒温箱中孵育1 h; 使用PBS洗涤3次后用HRP-SPA(1∶100)在37 ℃恒温箱中孵育1 h, 再使用PBS洗涤3次后加入ACE显色液避光显色15 min后在荧光显微镜下观察结果。

1.5.4 Western blot检测嵌合病毒Cap蛋白的表达

将所获嵌合病毒接种于PK-15细胞中，72 h后弃上清，加入适量裂解液，置于冰上裂解30 min, 用细胞刮铲将细胞刮下，离心后收集上清。之后按照常规方法进行蛋白电泳检测，并设正常PK-15细胞作为阴性对照。

1.5.5 重组病毒滴度测定

将第4代病毒液使用无血清的DMEM培养基进行稀释(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9),将稀释好的病毒液接种至96孔板中，每个稀释度加8个孔，并设立空细胞作为阴性对照。在细胞培养箱中培养72 h后，使用IPMA试验检测结果。

按照Reed-Muench法计算其TCID50,距离比例=(高于50%病变率的百分数-50%)/(高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数),LgTCID50=距离比例×稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数。

2、结果与分析

2.1 PCR扩增产物的鉴定

经琼脂糖凝胶电泳分析，成功扩增出PCV1缺失ORF2基因和PCV3 ORF2基因的PCR产物的目的条带，其大小分别为536 bp、521 bp和645 bp(图1)。经重叠PCR扩增出预期目的条带，其大小为1 702 bp(图2)。

2.2 PCV1-3全基因组的PCR产物克隆入pCI-tb206-2

PCV1-3全基因组的PCR产物克隆入pCI-tb206-2载体，获得重组质粒pCI-PCV1-3,经检测引物F4/R4进行PCR检测，扩增出目的条带，大小约为1 785 bp(图3),说明PCV1-3已成功克隆入pCI-tb206-2载体。将阳性质粒送生工生物工程股份有限公司进行测序。测序结果显示重组质粒插入序列与原基因序列一致，无碱基突变(测序结果略)。

2.3 免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)结果

将第4代重组病毒培养72 h进行IPMA检测，并设立未接毒无污染的PK-15细胞为阴性对照。如图4所示，拯救病毒能检测到细胞被染色，呈红棕色，而未接毒无污染的PK-15细胞没有被染色。结果表明，PCV1-3 DNA感染性克隆转染PK-15细胞时都具有感染性。

2.4 Western blot结果

蛋白免疫印迹试验表明PCV3 Cap蛋白在28 kDa处存在特异性条带，而阴性对照未接毒的PK-15细胞中则无蛋白的表达(图5)。

2.5 重组病毒滴度测定结果

重组病毒滴度测定结果见表3。按照Reed-Muench法计算其TCID50,得出病毒的滴度为105.13TCID50/mL。

3、讨论

目前在圆环病毒的4个血清型中，PCV3的研究成为关注的热点。PCV3已在多个国家的农场或养殖场中被检测到，但对于病毒的分离仍然很困难。有报道使用传染性克隆[12]拯救了整个病毒，如何有效预防PCV3的感染成为了世界养殖业共同关注的问题。有资料显示，PCV3会造成猪皮炎、肾病综合征和生殖衰竭，而且还会导致猪的免疫能力下降甚至出现免疫抑制，因此其疫苗的研制具有十分重要的经济意义。目前市场上PCV2的商品化疫苗有10余种，但还没有一种有效的疫苗来防控PCV3的感染。结合世界范围内PCV3的高感染率，很有必要研发出一种保护效力高、成本低的PCV3疫苗。

目前，国内外已有许多关于嵌合型PCV1-2的弱毒疫苗的相关报道[13,14,15,16],其构建方法是通过用PCV2的ORF2基因替换非致病性PCV1的相应片段，构建出一种嵌合病毒(PCV1-2),进而开发成为PCV2弱毒疫苗。已有报道表明，嵌合病毒PCV1-2免疫SPF仔猪后能够激发机体产生PCV2 ORF2抗体[17] 。汪正亮等通过PCV-2灭活疫苗免疫商品猪，商品猪皆产生了较高的体液免疫反应[18]。宋益等[19]运用嵌合猪圆环病毒PCV1-2接种BALB/c小鼠，结果显示，接种42 d后，全部的接种的小鼠血清皆成阳性，说明该嵌合病毒PCV1-2能够激发机体产生体液免疫应答。鉴于此，本试验根据圆环病毒之间的相似性，使用相同方法将PCV3 ORF2基因替换至PCV1基因中，构建出PCV1-3 DNA感染性克隆，该克隆转染进细胞后，能够在细胞表达并稳定传代。

感染性克隆拯救病毒的体外增殖能力能够受到多重因素的影响，因此必须保证构建的感染性DNA克隆序列不会发生变异，与其亲本病毒序列保持完全一致。在基因组构建过程中，最重要的就是防止碱基错配以及产物突变，本试验在重叠PCR过程中采用了高保真酶，确保了产物序列的稳定性，测序结果显示全基因组序列完全一致。重叠PCR技术被广泛应用于基因重组、基因定点突变、基因组连接等试验中[20,21,22]。本试验采用重叠PCR的方法将PCV3 ORF2基因替换至PCV1的基因组框架中，此方法可简单迅速的将2个片段连接在一起，不需要内切酶进行酶切，再经连接酶进行连接，更加省时省力，而且操作简单，为此后的序列构建提供一种新的思路。在与载体连接时，本试验运用了无缝连接的试验方法，该方法无需连接酶依赖体系，能够有效防止载体自连，所得到的阳性克隆即为目的结果，连接成功率高达95%以上，能够快速且高效的将片段连接至载体的任意位点，无需多重复杂的操作，同时也节约了时间。

目前，对PCV3的研究还处于起步阶段，但疫苗的研制已经迫在眉睫，本研究对PCV3的弱毒疫苗研制提出了一种新思路。研究结果表明成功构建了一种新型猪圆环嵌合病毒PCV1-3,为进一步研制成本低、见效快的PCV3疫苗奠定了基础。

4、结论

本研究成功构建了PCV1和PCV3的嵌合病毒PCV1-3。对第4代病毒进行滴度测定，效价为105.13TCID50/mL。

参考文献:

[14]程旭,宋益,盛瑜,等.嵌合型猪圆环病毒(PCV1-2)及PCV2 ORF2真核表达质粒对商品猪的免疫保护[J].中国兽医学报,2009,29(9):1097-1102.

[15]邵小雪,杨倩,孟凡伟,等.嵌合猪圆环病毒的构建[J].北京农学院学报,2016,31(1):55-59.

[18]汪正亮,周金柱,王小波,等.嵌合型猪圆环病毒(PCV1-2)灭活苗对商品猪免疫保护效力的研究[J].畜牧兽医学报,2013,44(12):1961-1969.

[19]宋益,朱丽娜,高崧,等.嵌合型猪圆环病毒1-2型感染性DNA克隆的构建及其对小鼠的免疫原性[J].微生物学报,2008,48(9):1234-1240.

[20]秦智,陈彦伯,李雨婷,等.重叠延伸PCR技术在单碱基定点突变中的作用[J].分子植物育种,2021,19(4):1157-1162.

文章来源:李佳昕,田瑶,韩先杰,杨莹,王硕,时建立,李琛,刘畅,彭喆,吴晓燕,韩红,李俊.嵌合型PCV1-3感染性克隆的构建及病毒拯救[J].家畜生态学报,2023,44(10):77-81+96.