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狂犬病毒在摇摆式反应器的培养工艺摸索

2024-05-20 65 上传者：管理员

摘要：目的探讨狂犬病毒采用鸡胚细胞在摇摆式反应器培养的工艺，为狂犬病毒的培养提供一种简便的新工艺。方法 2021年4月选取发育良好的9～11d鸡胚，在无菌环境下将其制备成原代鸡胚细胞后，将狂犬病毒CTNCEC25株和原代鸡胚细胞接种于一次性反应袋中，置于摇摆式反应器进行培养，通过对细胞密度(2.0×106、3.0×106、4.0×106和5.0×106个/ml)、感染复数(multiplicity of infection, MOI)(0.001、0.010、0.030、0.050、0.100)、溶氧(50%、70%、30%)、温度(32℃、33℃和34℃)等关键参数进行摸索，从而获得狂犬病毒最适的培养条件，并按照最适的培养条件培养3批病毒液验证该培养条件的稳定性。结果狂犬病毒CTNCEC25株在摇摆式反应器培养的最佳细胞密度为4.0×106～5.0×106个/ml、MOI为0.010～0.100、培养48h后的溶氧为50%、48h后的培养温度为32～34℃,采用该条件培养获得的病毒收获液滴度均在8.0lgFFU/ml以上，远高于中国药典规定的6.0lgFFU/ml。结论通过本研究，建立了狂犬病毒CTNCEC25株在摇摆式反应器的培养工艺，为鸡胚细胞狂犬病疫苗产业化生产提供了参考。

关键词：
抗原
摇摆式反应器
滴度
狂犬病毒
鸡胚细胞
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狂犬病毒(Rabies virus, RV)属于弹状病毒科，是一种严格嗜神经性病毒，可引起人畜共患病，一旦发病，死亡率几乎为100%[1,2]。我国是狂犬病高发国家，发病和死亡人数仅次于印度，居世界第二位[3,4,5]。接种狂犬病疫苗是防治人患狂犬病唯一的有效方法。

目前，国内培养人用狂犬病疫苗的方法有细胞工厂、生物反应器，其中生物反应器已成为放大培养的主要培养方法[6,7,8,9,10,11,12]。市面上常用的生物反应器有固定床反应器、机械搅拌式生物反应器、摇摆式生物反应器，本文旨在研究狂犬病毒CTNCEC25株在摇摆式生物反应器的培养效果，通过观察不同细胞密度、培养温度、感染复数(MOI),确定最佳培养工艺，为疫苗生产工艺的优化提供实验依据[13,14,15]。

1、材料与方法

1.1原代鸡胚细胞

无特定病原体(specific pathogen free, SPF)级种蛋于37～39℃、相对湿度40%～80%的孵蛋箱孵育。选择发育良好的9～11d的鸡胚，无菌取胚，去头，将组织剪成细小组织块，按照(5±2)ml/胚加入0.25%胰蛋白酶溶液，混匀，置于37℃水浴箱内消化(20±5)min,离心后，加入少量培养液吹打细胞，按(10±3)ml/胚的终体积加入细胞生长液制备成细胞悬液备用。

1.2毒种与细胞

狂犬病毒CTNCEC25株由本公司自主驯化获得(生物安全实验室资质编号：0308400122);BSR细胞株购于中国食品药品检定研究院。

1.3试剂和仪器

VirusPro®CEF细胞无血清培养基(货号：H5E5L7)购自上海源培生物科技股份有限公司；0.25%胰蛋白酶[含0.02%乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)],胰蛋白酶(货号：27250)购自美国Gibco公司；FITC标记的抗狂犬病毒单克隆抗体(货号：5500)购自美国Merck公司；抗狂犬病毒糖蛋白单克隆抗体[1C5](货号：ab82460)购自abcam;过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)偶联的羊抗鼠二抗(货号：ab6789)购自abcam;荧光倒置显微镜(型号：IX71)购自奥林巴斯；生物传感器分析仪(型号：S-10)购自西尔曼；摇摆式生物反应器(型号：SKC0600-0010)购自武汉赛科成；一次性反应袋(内含30g/L片状载体)购自武汉赛科成。

1.4不同细胞密度对狂犬病毒在摇摆式反应器培养的影响

取工作体积为2.5L的一次性反应袋，分别加入鸡胚细胞使其终浓度分别为2.0×106、3.0×106、4.0×106和5.0×106个/ml,将狂犬病毒CTNCEC25株按MOI 0.030接种于鸡胚细胞，按照37℃、pH7.4、溶氧70%、转速12rpm、角度7°的条件培养48h后，将培养条件改为34℃、pH7.6、溶氧50%继续培养，每天收获1次，连续收获3次，取样检测收获液的病毒滴度和抗原含量。试验重复2次。

1.5不同MOI对狂犬病毒在摇摆式反应器培养的影响

取工作体积为2.5L的一次性反应袋，每个反应袋的鸡胚细胞其终浓度为4.0×106个/ml,将狂犬病毒CTNCEC25株分别按MOI 0.001、0.010、0.030、0.050、0.100接种于鸡胚细胞，按照37℃、pH7.4、溶氧70%、转速12rpm、角度7°的条件培养48h后，将培养条件改为34℃、pH7.6、溶氧50%继续培养，每天收获1次，连续收获3次，取样检测收获液的病毒滴度和抗原含量。

1.6不同溶氧对狂犬病毒在摇摆式反应器培养的影响

取工作体积为2.5L的一次性反应袋，按照细胞密度4.0×106个/ml、MOI 0.030加入细胞和病毒，按照37℃、pH7.4、溶氧70%、转速12rpm、角度7°的条件培养48h后，将培养条件改为34℃、pH7.6继续培养，其中将48h后溶氧分别按50%、70%、30%进行设置，每天收获1次，连续收获3次，取样检测收获液的病毒滴度和抗原含量。

1.7不同培养温度对对狂犬病毒在摇摆式反应器培养的影响

取工作体积为2.5L的一次性反应袋，按照细胞密度4.0×106个/ml、MOI 0.030加入细胞和病毒，按照37℃、pH7.4、溶氧70%、转速12rpm、角度7°的条件培养48h后，将培养条件改为pH7.6、溶氧50%继续培养，将培养48h后的培养温度分别调整为32℃、33℃和34℃进行培养，每天收获1次，连续收获3次，取样检测收获液的病毒滴度和抗原含量。

1.8工艺验证

取工作体积为2.5L的一次性反应袋，采用上述摸索参数的结果进行3批工艺验证。

1.9病毒滴度检测

采用细胞荧光转化灶法进行毒种的病毒滴定。将毒种先做10倍系列稀释，再做3倍系列稀释。每个稀释度病毒液制备好后，加入1.0×106个/ml的BSR细胞悬液，每孔50μl,于37℃,5%CO2条件下培养24h。经80%冷丙酮-30℃固定10min,加入抗狂犬病毒荧光抗体，于37℃孵育30min。倒置荧光显微镜下观察，以两个相邻稀释度荧光病灶数量不超过30个/孔来计算病毒滴度。病毒滴度应不低于6.0lgFFU/ml。

1.10抗原含量检测

将待检抗原稀释2～8℃包被过夜，形成固相抗原。洗涤去除未结合的抗原和杂质，加入稀释6 000倍的抗狂犬病毒糖蛋白单克隆抗体，37℃孵育30min。经洗涤后，加入稀释60 000倍酶标抗抗体，37℃孵育60min。通过显色，在450nm和630nm波长测定吸光度值。根据吸光度值算出待检样品抗原的含量。

1.11统计学方法

使用Minitab 17.0软件进行统计分析，计量资料采用

表示，采用配对t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。检验水准α=0.05。

2、结果

2.1不同细胞密度对狂犬病毒在摇摆式反应器培养的影响

分别采用2.0×106、3.0×106、4.0×106和5.0×106个/ml的鸡胚细胞密度培养病毒，结果显示，不同细胞密度培养每次收获的滴度均在8.0～9.0lgFFU/ml范围内，均远高于标准6.0lgFFU/ml,且不同密度组间差异无统计学意义(t=-0.378、-0.400、0.286、0、1.512、2.000,P=0.742、0.728、0.802、1.000、0.270、0.184)。细胞密度在2.0×106和3.0×106个/ml的抗原差异无统计学意义(t=0.898,P=0.464)、4.0×106和5.0×106个/ml的抗原差异无统计学意义(t=-4.000,P=0.057)。而2.0×106和4.0×106个/ml(t=-4.400,P=0.048)、2.0×106和5.0×106个/ml(t=-4.670,P=0.043)、3.0×106和4.0×106个/ml(t=-5.892,P=0.028)、3.0×106和5.0×106个/ml(t=-7.750,P=0.016)间抗原差异有统计学意义；密度越高，获得的抗原结果也越高。细胞密度可选在4.0×106～5.0×106个/ml。见表1、图1。

表1不同细胞密度的滴度和抗原结果

图1不同细胞密度的滴度和抗原结果

2.2不同MOI对狂犬病毒在摇摆式反应器培养的影响

采用0.001、0.010、0.030、0.050和0.100的MOI接种于4×106个/ml的细胞密度进行培养，结果显示，不同MOI滴度均在7.9lgFFU/ml以上，各组间差异无统计学意义(t=-2.500、-2.000、-1.441、-1.512、-1.109、0.378、1.000、3.464、1.000,P=0.130、0.184、0.286、0.270、0.383、0.742、0.423、0.074、0.423);在抗原结果上，0.001的MOI与其他各组差异有统计学意义(t=-6.653、-4.857、-6.245、-5.768,P=0.022、0.040、0.025、0.029),MOI在0.010～0.100各组间差异无统计学意义(t=-1.000、-2.500、-1.750、-5.000、-2.000,P=0.423、0.130、0.222、0.058、0.184),且具有较高的抗原结果。选择MOI在0.010～0.100。见表2、图2。

表2不同MOI的培养效果

图2不同MOI的滴度和抗原结果

2.3不同溶氧对狂犬病毒在摇摆式反应器培养的影响

在48h后采用不同溶氧进行培养，滴度结果均在8.3lgFFU/ml以上，但溶氧50%的滴度结果对溶氧30%的滴度结果差异有统计学意义(t=7.000,P=0.020)。在抗原结果方面，溶氧30%的结果与50%、70%的差异有统计学意义(t=8.000、8.500,P=0.015、0.014);溶氧50%和溶氧70%的差异无统计学意义(t=-0.500,P=0.667)。综合滴度和抗原结果，采用50%溶氧作为培养48h后的溶氧条件。见表3、图3。

表3不同溶氧的培养效果

图3不同溶氧的滴度和抗原结果

2.4不同培养温度对对狂犬病毒在摇摆式反应器培养的影响

在48h后采用不同温度进行培养，经t检验分析，滴度结果(t=0、1.732、3.464,P=1.000、0.225、0.074)和抗原结果(t=-2.500、3.464、4.158,P=0.130、0.074、0.053)差异无统计学意义。48h后的培养温度可采用32～34℃。见表4、图4。

表4不同温度的培养效果

图4不同温度的滴度和抗原结果

2.5工艺验证

按照细胞密度4.0×106个/ml、MOI 0.030加入细胞和病毒，按照37℃、pH7.4、溶氧70%、转速12rpm、角度7°的条件培养48h后，将培养条件改为33℃、pH7.6、溶氧50%继续培养，每天收获病毒液1次，连续收获3次，测定滴度和抗原。重复3批。3批结果的滴度均>8.0lgFFU/ml,平均抗原结果均>1.5IU/ml。见表5。

表5不同批次收获液的培养效果

3、讨论

CTNCEC25株为适应鸡胚细胞的狂犬病毒株[16],该病毒的培养工艺主要采用细胞工厂培养，同时市场上原代细胞的培养工艺大多为转瓶或细胞工厂，而细胞工厂存在手工操作多、占地面积大、劳动强度大等缺点，随着生物技术的发展，目前大多采用生物反应器进行培养，从而提高工作效率。本文采用的细胞为原代鸡胚细胞[17],使用含片状载体的一次性反应袋在摇摆式生物反应器进行培养。该反应袋主要由聚乙烯聚酯纤维制成，是一种已灭菌、即装即用、不可重复利用的培养器。该反应器可实现高密度培养，大大提高了生产效率[18,19,20]。

影响病毒滴度的关键因素包括细胞密度、病毒MOI、病毒接种时间、培养温度和培养时间等。本研究选取了细胞密度、MOI、溶氧和培养温度对摇摆式反应器的培养工艺进行摸索，结果显示，CTNCEC25株在培养过程均能产生较高的滴度，因而抗原出现一定的差异，通过抗原的差异找出最优的参数。抗原检测结果的差异性较滴度大，可能主要由于抗原检测采用的是ELISA方法检测，人为干扰较少；而滴度检测是通过人观察荧光斑点得出，且结果是对数级别，因此误差较大。最后经3批工艺验证结果显示使用该条件在摇摆式反应器培养可获得高滴度、高抗原的病毒收获液。

综上，本研究的结果显示狂犬病毒和鸡胚细胞在摇摆式生物反应器采用细胞密度在4.0×106～5.0×106个/ml、MOI在0.010～0.100、48h的溶氧条件为50%、48h后的培养温度32～34℃培养可获得的病毒滴度在8.0lgFFU/ml以上，为鸡胚细胞狂犬病疫苗产业化生产提供了参考。

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