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TSA通过激活STAT1信号通路上调肺癌细胞HLA-Ⅰ的表达

2020-11-16 216 上传者：管理员

摘要：为探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histonedeacetylaseinhibitor,HDACI)——曲古抑菌素(trichostatinA,TSA)上调肺癌细胞HLA-Ⅰ表达的作用机制,利用CCK-8试验确定TSA处理A549细胞、H520细胞的最适药物浓度,RT-PCR、Westernblotting分别检测TSA处理细胞后HLA-Ⅰ、信号传导及转录激活因子1(signaltransducersandactivatorsoftranscription1,STAT1)在基因和蛋白水平的表达。为进一步探究TSA上调HLA-I表达的机制,设置加药时间梯度检测TSA作用后磷酸化STAT1(phospho-STAT1,p-STAT1)的表达,同时采用核质分离试验检测TSA处理后STAT1核质的表达变化,最后通过siRNA试验检测干扰STAT1后HLA-Ⅰ的表达变化。结果显示,在A549细胞和H520细胞中,TSA的最适药物浓度是50nmol/L;通过RT-PCR、Westernblotting检测发现,TSA可以上调HLA-Ⅰ表达,p-STAT1的表达增强说明STAT1通路被TSA激活;核质分离试验证明,TSA可以促进STAT1入核;siRNA试验显示,在干扰STAT1后HLA-Ⅰ表达下调。以上结果提示,TSA通过激活STAT1信号通路上调肺癌细胞HLA-Ⅰ表达。

关键词：
人类白细胞抗原Ⅰ类分子
信号传导及转录激活因子
恶性肿瘤
曲古抑菌素
肺癌
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肺癌是最常见的恶性肿瘤之一,严重威胁人类健康[1],传统的肺癌治疗效果并不乐观,人们逐渐认识到免疫系统在肺癌治疗中的重要性。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histonedeacetylaseinhibitor,HDACI)主要通过调节组蛋白及转录因子等乙酰化状态改变基因表达,从而起到抑制肿瘤增殖、侵袭、转移以及分化的作用[2]。HDACI已成为肿瘤靶向治疗领域的研究热点,其对肿瘤细胞具有相对较高的选择性,同时也具有低毒性优点。有研究发现,HDACI能够增强T细胞介导的肿瘤免疫功能[3]。然而,其机制至今尚未明了。因此,阐明HDACI增强肿瘤免疫应答的机制具有重要意义。

在肿瘤的发生、发展过程中,免疫逃逸是其重要的特征之一。HLA-Ⅰ是一种在细胞表面广泛表达的蛋白,能够有效地提高CTL对肿瘤的识别杀伤能力,低表达HLA-Ⅰ是肿瘤免疫逃逸的重要原因之一[4]。为探究HDACI——曲古抑菌素(trichostatinA,TSA)发挥抗肿瘤效应的可能免疫机制,本研究就TSA对肺癌细胞HLA-Ⅰ表达的影响及其机制进行了分析。

1、材料与方法

1.1 材料

肺腺癌A549细胞株、肺鳞癌H520细胞株(中国科学院上海生命科学研究院),FCS、DMEM高糖培养液、RMPI1640培养液(BI公司),0.25%胰蛋白酶(上海碧云天生物技术有限公司),TRIzol试剂、LipofectamineTM2000(Invitrogen公司),信号传导及转录激活因子1(signaltransducersandactivatorsoftranscription1,STAT1)siRNA及其阴性对照(由上海吉玛科技有限公司合成),荧光定量PCR检测试剂盒(TaKaRa公司),基因引物(由通用生物公司合成),TSA(Sigma公司),CCK-8检测试剂盒(日本同仁公司),Histone3、β-actin、GAPDH抗体(Proteintech公司),HLA-Ⅰ抗体(华安生物技术有限公司),STAT1、磷酸化STAT1(phospho-STAT1,p-STAT1)抗体(CellSignalingTechnology公司),细胞总蛋白提取试剂盒(贝博生物技术有限公司),增强化学发光(enhancedchemiluminescence,ECL)试剂盒(南京Vazyme公司),核质分离试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

A549细胞用含有10%FCS的DMEM培养液、H520细胞用含有10%FCS的RMPI1640培养液在37℃5%CO2的温箱中培养。在细胞生长达到80%～90%融合度时进行传代,待细胞状态良好时进行后续试验。

1.2.2 CCK-8试验确定TSA试验浓度

取对数生长期细胞,消化后用鲍氏计数板计数细胞,以1×105/mL密度接种于96孔板中,二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO)组(对照组)和TSA组分别设置4个复孔,待细胞完全贴壁后将0、2.25、3.125、4.5、6.25、9、12.5、18、25、36、50、75、100和150nmol/L的TSA加入96孔板中,同时设置不含细胞和培养液的空白孔,48h后加入10μL的CCK-8试剂,放入温箱分别于0.5、1、2、3和4h测定光密度[D(450nm)],选取线性最好的D根据公式计算对应的细胞存活率。

1.2.3 细胞瞬时转染

取对数生长期细胞,消化后接种于6孔板中,待细胞汇合至40%～60%时进行转染。按照LipofectamineTM2000转染试剂说明书进行操作,将siRNA溶解于Opti-MEM培养液中,同时另取LipofectamineTM2000试剂加入Opti-MEM培养液中,分别轻弹、混匀,室温孵育5min,然后将两者轻轻混合,室温静置25min。期间将6孔板细胞培养液更换为无血清培养液,同时将上述配好的转染混合物加入各组细胞,置于细胞培养箱中培养。4～6h后,将培养液更换为含10%FCS的完全培养液继续培养。

1.2.4 RT-PCR检测STAT1、HLA-Ⅰ基因表达

用预冷的PBS洗涤细胞3次,用TRIzol试剂裂解细胞并进行后续的RNA提取步骤,在获取RNA后用TaKaRa反转录试剂盒将RNA反转录成相应的cDNA,最后按照TaKaRa试剂盒说明书上的用量加入引物、cDNA、5×mix试剂混匀后上机(ABI7500)检测相应基因的表达情况。扩增条件为:95℃30s,95℃5s,60℃34s,40个循环。以GAPDH为内参计算目的基因的mRNA相对表达量。(表1)

1.2.5 Westernblotting检测STAT1、HLA-Ⅰ等蛋白表达

用预冷的PBS洗涤细胞3次,每孔加入约80μL的蛋白裂解液,冰上裂解15min,用细胞刮将细胞从6孔板底部刮离,使细胞和裂解液充分混匀继续裂解15min,4℃以15000×g离心20min,收集上清液,即为总蛋白。用二喹啉甲酸(bicinchoninicacid,BCA)法进行蛋白定量分析。以相同质量的蛋白上样,80V电压进行SDS-PAGE,进行300mA90min的电转操作,将胶上的蛋白质转至聚偏二氟乙烯(polyvinylidenefluoride,PVDF)膜上,电转结束后用10%脱脂牛奶室温封闭2h,再分别加入STAT1(1∶1000)、HLA-Ⅰ(1∶1000)、p-STAT1(1∶1000)、β-actin(1∶1000)、H3(1∶1000)、GAPDH(1∶6000)抗体4℃摇床孵育过夜。次日用TBST洗膜3次(10min/次),加入二抗(1∶6000),室温孵育1.5h,TBST洗膜3次(10min/次)。以β-actin、GAPDH作为内参,使用ECL试剂盒检测STAT1、HLA-Ⅰ等蛋白的表达情况。

表1荧光定量PCR引物

1.3 统计学处理

用SPSS19.0软件进行统计分析,以上试验均重复3次,数据以x¯±sx¯±s表示,组间比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 TSA试验药物作用浓度的测定

本研究用TSA对A549细胞及H520细胞进行不同药物浓度的处理,培养48h后采用CCK-8试剂盒检测不同药物浓度下细胞的存活情况。结果显示,在A549细胞和H520细胞中,当TSA浓度<50nmol/L时细胞存活率>90%,当TSA浓度>50nmol/L时细胞存活率<85%。为不影响细胞存活,利于后续试验的开展,最终确定以50nmol/L作为TSA的最适药物浓度。(图1)

图1不同浓度的TSA作用后A549细胞和H520细胞的活力变化

2.2 TSA处理后HLA-Ⅰ的表达

用50nmol/L的TSA分别处理A549细胞和H520细胞0、24h,提取总RNA进行RT-PCR。结果显示,TSA作用24h后,HLA-ⅠmRNA表达水平与对照组相比显著上调(图2A、图2B)。同时,在TSA处理A549细胞和H520细胞0、48h后,提取细胞总蛋白进行Westernblotting检测。结果显示,HLA-Ⅰ的蛋白表达水平与对照组相比也上调(图2C、图2D)。以上结果表明,TSA能够上调肺癌细胞HLA-Ⅰ的表达。

图2RT-PCR、Westernblotting检测TSA处理后细胞HLA-Ⅰ的表达

2.3 TSA处理后STAT1、HLA-Ⅰ的表达

STAT1能够上调HLA-Ⅰ的表达,为探究TSA上调HLA-Ⅰ的表达是否通过作用于STAT1实现的,采用RT-PCR进行检测。结果显示,与对照组比较,在用TSA处理A549细胞24h后STAT1、HLA-ImRNA表达上调(P<0.05,图3A)。Westernblotting结果显示,在TSA处理A549细胞24、48h后STAT1、HLA-Ⅰ蛋白表达水平升高(图3B)。以上结果表明,TSA能够同时上调STAT1、HLA-ⅠmRNA及蛋白表达水平。

2.4 TSA激活STAT1通路促进STAT1入核

为进一步探究TSA对STAT1、HLA-Ⅰ的作用机制,设置0、10、30、60和120min的加药时间梯度检测p-STAT1、HLA-Ⅰ的表达水平。与对照组比较,p-STAT1、HLA-I表达增强,说明TSA能够激活STAT1通路。利用核质分离试剂盒分离A549细胞核质成分,通过Westernblotting检测发现,STAT1在TSA处理后发生了核转位。(图4)

图3RT-PCR、Westernblotting检测TSA处理后A549细胞STAT1、HLA-Ⅰ的表达

图4TSA对STAT1通路及STAT1的作用

2.5 干扰STAT1后HLA-Ⅰ的表达

为证明TSA是通过激活STAT1通路上调HLA-Ⅰ表达,本研究在A549细胞中转染特异性si-STAT1,RT-PCR、Westernblotting结果显示,与转染对照组(si-RNA-NC组)比较,在转染si-STAT1后HLA-Ⅰ在基因及蛋白水平表达降低,表明TSA通过激活STAT1通路上调HLA-Ⅰ表达。(图5)

图5干扰STAT1后HLA-Ⅰ的表达

3、讨论

肺癌的高发病率和高死亡率仍然是威胁人类健康的主要问题,急需探索有效的治疗方法[5,6]。目前已证实,组蛋白去乙酰化酶(histonedeacetylase,HDAC)在染色质的重构和基因的表达过程中起着至关重要的作用[7]。有研究发现,组蛋白乙酰化酶(histoneacetyltransferase,HAT)能够促进组蛋白乙酰化,使染色质结构松散,减弱DNA与组蛋白间的相互作用,有利于促进转录因子与DNA模板相结合而激活转录,而HDAC会降低组蛋白乙酰化水平,使染色质结构更加紧密,造成转录因子不易与DNA启动子结合,导致基因转录沉默,最终致使肿瘤形成[8]。已经证实,HDACI可以抑制肿瘤的增殖、侵袭、转移、分化,增强T细胞介导的肿瘤免疫功能[3]。目前,TSA显示了良好的应用前景,然而其增强T细胞介导的肿瘤免疫机制尚未明了。

肿瘤免疫逃逸是导致临床肿瘤免疫治疗失败的重要原因[9]。研究发现,肿瘤细胞本身在调节宿主免疫反应方面发挥着重要作用,可以逃避免疫监测[10]。HLA-Ⅰ能够将肿瘤细胞表面抗原呈递给免疫系统,HLA-Ⅰ的表达水平与CTL抗原呈递明显相关[11]。因此,HLA-Ⅰ类抗原的低表达是肿瘤免疫治疗应答的负性因素[12,13],上调肿瘤细胞表面HLA-Ⅰ的表达能够有效地提高免疫应答过程[14]。

在本研究中,首先通过CCK-8试验确定了TSA最适试验浓度,RT-PCR、Westernblotting结果表明,TSA能够上调A549细胞、H520细胞中HLA-I的表达水平,提示TSA可能通过增强肿瘤细胞HLA-Ⅰ表达提高免疫应答过程。有研究发现,JAK/STAT1通路是重要的免疫调节通路,细胞因子通过JAK/STAT1信号通路来传导信号,在细胞因子的刺激下STAT1通路被激活,STAT1作为转录因子入核与下游靶基因启动子区域结合进而调控基因的转录表达[15]。另有研究发现,HLA-Ⅰ的表达受STAT1通路的调控[16,17]。因此,本研究在加入TSA后检测了STAT1分子的表达情况。与对照组比较,STAT1表达上调,提示TSA可能通过激活STAT1通路上调HLA-Ⅰ的表达。本研究设置加药时间梯度检测p-STAT1的表达,结果发现p-STAT1表达增强,进一步证实了TSA能够激活STAT1通路。同时,本研究通过核质分离的方法证实TSA能够促进STAT1入核,推测TSA在激活STAT1通路后,STAT1可能作为转录因子入核调控HLA-Ⅰ的表达。本研究通过转染特异性si-RNA敲低STAT1表达,结果显示,在干扰STAT1表达后HLA-I表达下调,证实TSA能够通过激活STAT1通路上调HLA-Ⅰ表达,推测TSA激活STAT1通路上调肺癌细胞HLA-Ⅰ表达可能是其增强抗肿瘤免疫应答的重要机制。

综上所述,本研究不仅揭示了TSA能够上调肺癌细胞HLA-Ⅰ类分子的表达,同时证实了TSA诱导肺癌细胞HLA-Ⅰ表达的重要机制,后续研究中需继续探讨TSA上调HLA-Ⅰ对肺癌抗肿瘤免疫应答的具体作用机制及效应,为TSA用于肺癌的免疫治疗提供新见解、新思路。

杨瑞,王昊,王保龙.TSA通过激活STAT1信号通路上调肺癌细胞HLA-Ⅰ表达[J].现代免疫学,2020,40(05):366-371.