RA是滑膜细胞异常增殖而侵入软骨组织,促进炎性因子分泌,最终造成软骨组织内慢性炎症的自身免疫性疾病[1]。成纤维细胞样滑膜细胞(fibroblast-likesynoviocytes,FLS)是RA发生过程中的主要效应细胞,FLS过度增殖或凋亡能力降低可破坏关节软骨组织结构并造成慢性炎症反应[2]。目前,临床上采用甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)等免疫抑制剂治疗RA,但其毒副作用较大[3]。磷脂酰肌醇激酶(phosphoinositide3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(proteinkinaseB,AKT)信号通路激活可加重软骨组织内炎症反应[4,5]。研究发现,淫羊藿苷(icariin,ICA)可增强机体免疫力,抑制骨关节炎软骨细胞凋亡,促进细胞增殖,但关于其具体作用机制尚不明确[6,7,8]。因此,本研究主要探讨ICA是否通过调控PI3K/AKT信号通路诱导RAFLS凋亡,以期为ICA用于RA治疗提供理论依据。

1、材料与方法

1.1 滑膜组织标本采集

选择2016年5月至2017年3月襄阳市中心医院行膝关节滑膜清理术的RA患者(12例)为研究对象,其中男性7例、女性5例,年龄(52.36±8.13)岁,病程为(36.34±5.56)个月。所有RA患者均符合相关诊断标准[9],于术中切除滑膜组织。研究对象对本研究均知情同意。

1.2 材料与试剂

正常人滑膜细胞购自北京裕恒丰科技有限公司;FCS、RPMI1640培养液购自Sigma公司;细胞凋亡检测试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司;ICA购自上海佳和生物科技有限公司;IL-6与TNF-αELISA检测试剂盒购自上海逸峰生物科技有限公司;MTT购自广州朗日生物技术有限公司;二喹啉甲酸(bicinchoninincacid,BCA)蛋白浓度检测试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司;MTX购自北京索莱宝科技有限公司;二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO)购自Hyclone公司;细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、裂解的半胱氨酸蛋白酶3(CleavedCaspase-3)、B淋巴细胞瘤2基因(B-celllymphoma2,Bcl-2)、Bcl-2相关蛋白(Bcl-2-associatedXprotein,Bax)、PI3K及其磷酸化PI3K(phospho-PI3K,p-PI3K)抗体、AKT及其磷酸化AKT(phospho-AKT,p-AKT)兔单克隆抗体购自CellSignalingTechnology公司;辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)标记的山羊抗兔IgG二抗、增强化学发光(enhancedchemiluminescence,ECL)试剂购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 RAFLS的分离及鉴定

RAFLS分离:在无菌条件下,用PBS冲洗RA滑膜组织,将其置于含有10%FCS的RPMI1640培养液的离心管内,用胰蛋白酶消化细胞,去除脂肪、纤维组织及血管等,用无菌PBS冲洗5次(10min/次);将滑膜组织剪成体积约为1mm×1mm×1mm小块,加入Ⅱ型胶原酶和0.25%胰蛋白酶,放入含有5%CO2的37℃恒温培养箱内培养2h;用纱网过滤,在4℃条件下以1100×g离心10min,弃上清液,加入含有20%FCS的RPMI1640培养液重悬细胞,充分混匀,将其接种至培养瓶内,继续培养24h后换液,弃未贴壁细胞,其余细胞待其完全长满后进行传代培养,稳定传代3～6次后进行后续试验。RAFLS鉴定:取第3代细胞接种于6孔板,每孔预先平铺盖玻片,待细胞生长达到70%时,弃培养液;预冷PBS洗涤,在4℃条件下加入4%多聚甲醛固定24h,预冷PBS洗涤固定液,用封闭液封闭1h,使用去封闭液,加入抗血管黏附分子1(antivascularadhesionmolecule1,VCAM-1)一抗(1∶200),放入湿盒内于4℃条件下孵育24h;预冷PBS洗涤,加入二抗(1∶1000),放入湿盒内于4℃条件下孵育1h;PBS洗涤3次(5min/次),加入4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI),室温避光孵育5min;PBS洗涤5次(5min/次),在载玻片上滴加抗荧光淬灭封片液,将贴有细胞的盖玻片置于载玻片上,放入激光共聚焦显微镜下观察。

1.3.2 试验分组

将RAFLS接种于96孔板,每孔约6×103个细胞,放入含有5%CO2的37℃恒温培养箱中培养。待细胞贴壁生长后将其随机分为阴性对照(negativecontrol,NC)组(没有进行任何处理的细胞)、LPS组、LPS+ICA25μmol/L组、LPS+ICA50μmol/L组、LPS+ICA100μmol/L组、LPS+MTX50mg/L组,其中LPS组使用浓度为50μg/mL的LPS处理RAFLS48h;LPS+ICA25μmol/L组、LPS+ICA50μmol/L组、LPS+ICA100μmol/L组分别使用浓度为25、50和100μmol/L的ICA孵育细胞12h后,加入LPS继续培养至48h;LPS+MTX50mg/L组使用浓度为50mg/L的MTX干预细胞12h后,加入LPS继续培养至48h[10,11]。

1.3.3 MTT法检测人RAFLS的增殖能力

收集各组处理后RAFLS,每孔分别加入20μLMTT溶液,放入含有5%CO2的37℃恒温培养箱中继续培养4h;弃培养液,每孔分别加入100μLDMSO溶液,室温振荡溶解,利用酶标仪检测各孔的光密度[D(490nm)]。每组均设置6次重复。

1.3.4 克隆细胞形成试验检测RAFLS的克隆形成能力

待各组药物作用时间为2周时分别收集各组RAFLS,预冷PBS洗涤细胞2次(5min/次),采用5%甲醛固定30min,PBS洗涤细胞3次(5min/次),使用结晶紫染色30min,PBS洗涤细胞3次(5min/次),晾干后使用相机拍照。

1.3.5 ELISA检测RAFLS炎性因子的分泌水平

药物处理24h后收集各组细胞培养液,在4℃条件下以9700×g离心5min,严格按照ELISA试剂盒说明书进行操作,利用酶标仪检测各组D,根据绘制的标准蛋白曲线计算各组细胞培养上清液中TNF-α、IL-6的水平。

1.3.6 流式细胞术检测细胞的凋亡情况

收集药物处理48h后的各组RAFLS(1×105个细胞/组),加入500μLBindingBuffer悬浮细胞,加入5μLAnnexinV-FITC充分混匀,加入5μLPI,充分混匀后室温避光孵育10min,采用流式细胞术检测各组RAFLS的凋亡率。

1.3.7 Westernblotting检测相关蛋白的表达水平

取对数生长期各组RAFLS,弃培养液,预冷PBS洗涤细胞3次(5min/次),加入细胞蛋白裂解液后置于冰上裂解细胞15min,收集蛋白裂解液,在4℃条件下以9700×g离心15min,收集上清液即蛋白,采用BCA法测定蛋白浓度;蛋白变性后加入SDS-PAGE凝胶孔内进行电泳反应,转膜,5%脱脂牛奶于室温条件下封闭1h,预冷TBST洗膜3次(10min/次),加入稀释后的蛋白一抗(1∶1000),4℃孵育24h,预冷TBST洗膜3次(10min/次),加入稀释后的蛋白二抗(1∶2000),4℃孵育2h,TBST洗膜3次(10min/次),滴加ECL孵育1h,应用凝胶分析系统及ImageJ软件分析蛋白条带灰度值。

1.4 统计学处理

应用SPSS21.0软件进行统计分析,计量资料以x¯x¯±s表示,两组间比较采用t检验,多个样本均数比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD法,数据均进行正态分布性检验,对非正态分布数据采用Kruskal-Wallis秩和检验进行分析,以P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 ICA对LPS诱导人RAFLS增殖活性的影响

ICA对正常人滑膜细胞活性无明显影响;与NC组比较,LPS组FLS增殖活性明显升高(P<0.05),CyclinD1表达水平显著升高(P<0.05);与LPS组比较,ICA不同剂量组FLS增殖活性均明显降低(P<0.05),CyclinD1表达水平显著降低(P<0.05)。(图1)

图1不同浓度的ICA对LPS诱导人RAFLS增殖和增殖蛋白CyclinD1表达的影响

2.2 ICA对LPS诱导人RAFLS克隆形成的影响

与NC组比较,LPS组FLS克隆形成率明显升高(P<0.05);与LPS组比较,ICA不同剂量组FLS克隆形成率均明显降低(P<0.05)。(图2)

2.3 ICA对LPS诱导人RAFLS炎性因子分泌的影响

与NC组比较,LPS组RAFLS分泌TNF-α、IL-6水平均显著升高(P<0.05),而ICA不同剂量组RAFLS分泌TNF-α、IL-6水平均显著低于LPS组(P<0.05)。(图3)

图2不同浓度的ICA对LPS诱导人RAFLS克隆形成的影响

图3不同浓度的ICA对LPS诱导人RAFLS炎性因子分泌的影响

2.4 ICA对LPS诱导人RAFLS凋亡的影响

与NC组比较,LPS组RAFLS凋亡率显著降低(P<0.05);与LPS组比较,ICA不同剂量组RAFLS凋亡率均显著升高(P<0.05)。(图4)

2.5 ICA对LPS诱导人RAFLS凋亡相关蛋白表达的影响

与NC组比较,LPS组RAFLS中CleavedCaspase-3、Bax表达水平均显著降低(P<0.05),而Bcl-2表达水平显著升高(P<0.05);与LPS组比较,ICA不同剂量组RAFLS中CleavedCaspase-3、Bax表达水平均显著升高(P<0.05),而Bcl-2表达水平显著降低(P<0.05)。(图5)

2.6 ICA对LPS诱导人RAFLSPI3K/AKT信号通路的影响

与NC组比较,LPS组RAFLS中p-PI3K、p-AKT蛋白表达水平均显著升高(P<0.05);与LPS组比较,ICA不同剂量组RAFLS中p-PI3K、p-AKT蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)。(图6)

图4不同浓度的ICA对LPS诱导人RAFLS凋亡的影响

图5不同浓度的ICA对LPS诱导人RAFLS凋亡相关蛋白CleavedCaspase-3、Caspase-3、Bax和Bcl-2表达的影响

图6不同浓度的ICA对LPS诱导人RAFLSPI3K/AKT信号通路蛋白p-PI3K、PI3K、p-AKT和AKT表达的影响

3、讨论

RA是一种临床常见疾病,其所致的关节腔内滑膜炎及细胞类肿瘤样增生均可导致关节畸形。RA患者的关节滑膜中滑膜细胞过度增殖,滑膜细胞主要包括FLS和巨噬细胞样滑膜细胞[12,13,14]。因此,如何促进FLS凋亡对减轻RA患者的炎症状态并减缓疾病进展进而降低患者致残率至关重要。

ICA可通过抑制Caspase-3激活而抑制自发性高血压大鼠心肌细胞凋亡,还可抑制氧化低密度脂蛋白诱导的细胞凋亡[15,16]。本研究通过用LPS诱导FLS模拟RA患者体内慢性炎症状态,并采用不同浓度的ICA处理细胞。结果显示,LPS可促使FLS增殖并抑制其凋亡,可提高细胞克隆形成率,ICA处理后可抑制FLS增殖及细胞克隆形成并诱导其凋亡。这与上述研究报道不同,原因可能为ICA对不同类型疾病的作用效果不同,如ICA能显著抑制人食管癌EC9706细胞增殖并促进细胞凋亡,其作用机制可能与上调Bax、下调Bcl-2的表达相关[17]。进一步研究发现,ICA可明显抑制Bcl-2、CyclinD1表达,促进CleavedCaspase-3、Bax表达。已有研究发现,CyclinD1表达升高可促进细胞增殖,Bax表达升高可增加线粒体外膜通透性进而促使细胞色素C释放,导致下游Caspase-3活化并发生级联反应,最终促进细胞凋亡[18]。提示ICA可通过调控细胞增殖及凋亡相关蛋白的表达抑制FLS增殖并促进其凋亡。

TNF-α、IL-6等炎性因子分泌水平增加可促进RAFLS增殖、迁移及侵袭[19]。本研究结果显示,LPS处理后RAFLS分泌TNF-α、IL-6炎性因子水平明显升高,而ICA处理后可明显降低TNF-α、IL-6水平,提示ICA可能通过降低关节滑膜组织内炎症反应抑制RA的炎症反应。研究发现,PI3K/AKT信号通路激活与RAFLS抗凋亡特性有关[20,21]。本研究结果显示,LPS明显促进p-PI3K、p-AKT表达,而ICA明显抑制p-PI3K、p-AKT表达,提示ICA可能通过抑制PI3K/AKT信号通路活化而促进RAFLS凋亡,最终减缓疾病进展。

综上所述,ICA可促进RAFLS凋亡并抑制其增殖,同时降低炎症反应,其可能的作用机制与抑制PI3K/AKT信号通路活化有关。进一步证实ICA对RA的治疗价值,可为下一步探讨ICA治疗RA的作用机制提供指导依据。但本研究结果仅说明ICA可抑制PI3K/AKT信号通路,并通过减轻炎症反应促进RAFLS凋亡,关于其内在的作用机制仍需进一步研究。

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