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非小细胞肺癌患者血清长链非编码RNA-GAS5的表达

2021-04-05 171 上传者：管理员

摘要：目的：研究非小细胞肺癌（non-small-celllungcancer,NSCLC）患者血清中长链非编码RNA(longnon-codingRNA,lncRNA)-GAS5、微小RNA(microRNA,miR)-96-5p的表达及临床意义。方法：选择2018年2月至2019年2月山东省青岛市胶州中心医院收治的89例NSCLC患者作为NSCLC组，64例良性肺部疾病患者作为良性肺病组，同期42例健康体检者作为正常对照组。应用荧光实时定量PCR(qRT-PCR)检测3组受试者血清中lncRNA-GAS5、miR-96-5p的表达情况并分析其与临床病理特征之间的关系。采用生物信息学方法对lncRNA-GAS5与miR-96-5p的相互作用位点进行预测。采用受试者工作特征（receiveroperatingcharacteristic,ROC）曲线下面积（areaunderthecurve,AUC）评价lncRNA-GAS5、miR-335-5p单独及联合应用对NSCLC的诊断效能。结果：与正常对照组及良性肺病组相比，NSCLC组血清lncRNAGAS5表达明显降低，而miR-96-5p表达明显升高，差异有显著性（P<0.05）。血清中lncRNA-GAS5与miR-96-5p的表达呈负相关（r=-0.643,P=0.000）。生物信息学预测结果显示，lncRNA-GAS5序列的338～360碱基处有与miR-96-5p互补结合的核苷酸位点。不同肿瘤分期、淋巴结转移的NSCLC患者血清lncRNA-GAS5、miR-96-5p表达差异有显著性（P<0.05）。与lncRNA-GAS5及miR-96-5p单独检测相比，二者联合应用对NSCLC诊断的敏感性、准确性、阴性预测值较高，而特异性、阳性预测值较低（均P<0.05）。结论：NSCLC患者血清中lncRNA-GAS5表达降低，miR-96-5p表达升高，且与肿瘤分期及淋巴结转移有关，有望成为诊断NSCLC新的血清标志物。

关键词：
微小RNA
血清标志物
长链非编码RNA
非小细胞肺癌
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肺癌全球每年新发患者约209万例，死亡患者约176万例，是发病率及死亡率最高的恶性肿瘤[1]。非小细胞肺癌（non-small-celllungcancer,NSCLC）是肺癌最常见的组织学分类亚型，病理上包括肺腺癌、肺鳞癌及大细胞癌。目前NSCLC的治疗包括手术、放化疗、靶向药物及免疫治疗等，但部分患者诊断时已伴有转移，预后不佳，5年生存率仅20%[2]。深入研究NSCLC的发生机制，寻找早期诊断的血清肿瘤标志物意义重大。非编码RNA是调控基因表达的RNA分子，根据核苷酸的长度，分为长链非编码RNA(long-noncodingRNA,lncRNA）、微小RNA(microRNAs,miR）等，可参与细胞分化、发育等生物学过程，与心血管疾病、肿瘤等关系密切[3,4]。lncRNA-GAS5位于人类染色体1q25.1。研究显示，lncRNA-GAS5具有发挥抑制肿瘤的生物学功能，其表达降低可促进致癌基因YAP的磷酸化，促进肿瘤细胞的增殖并抑制其凋亡，从而导致肿瘤进展[5,6]。miR-96-5p位于人类7号染色体，可结合靶基因mRNA的3’端非编码区，调节基因表达。IWAI等[7]研究发现，肿瘤中miR-96-5p的表达上调能够通过靶向抑制caspase-9的表达而抑制肿瘤细胞凋亡，并作为促癌基因促进肿瘤进展。本研究检测了NSCLC患者血清中lncRNA-GAS5和miR-96-5p的表达情况，并初步探讨了其临床意义。

1、资料与方法

1.1临床资料

选择2018年2月至2019年2月青岛市胶州中心医院收治的89例NSCLC患者作为NSCLC组。纳入标准：(1)通过支气管镜活检或手术活检获取标本，经组织病理学检测确诊为NSCLC;(2)初诊，无肿瘤治疗史；(3)患者配合相关检查及治疗，临床资料完整。排除标准：(1)伴肺脓肿等肺部良性疾病；(2)伴感染性疾病、自身免疫系统疾病等；(3)伴心、肺、肝、肾等脏器功能不全。NSCLC组：男56例，女33例，年龄34～78岁，平均（56.8±6.4）岁；有吸烟史37例；病理类型：肺腺癌51例，肺鳞癌38例；肿瘤大小：≤5cm50例，>5cm39例；肿瘤分期：Ⅰ～Ⅱ期61例，Ⅲ～Ⅳ期28例；病理分级：中高分化48例，低分化41例；淋巴结转移24例。以同期住院诊治的64例良性肺部疾病患者作为良性肺病组：男41例，女23例；年龄33～70岁，平均（55.1±6.3）岁；有吸烟史26例；肉芽肿性炎21例，肺良性结节11例，肺结核12例，肺脓肿20例。以同期体检中心42例健康查体者作为正常对照组：男27例，女15例；年龄30～69岁，平均（54.8±6.6）岁；有吸烟史17例。三组性别、年龄及吸烟史差异无显著性（P>0.05）。本研究所有受试者均知情并签署知情同意书，本研究符合赫尔辛基宣言原则，且经医院伦理委员会批准。

1.2检测方法

实时定量PCR检测血清lncRNA-GAS5、miR-96-5p的表达。三组受试者清晨空腹取静脉血5ml，室温静置2h,3000r/min离心10min，吸取上层血清，-80℃保存待测。取400μl血清，用mirVana™miRNA分离试剂盒提取血清总RNA（赛默飞，货号AM1560），微量分光光度计测定RNA的纯度，OD260/OD280介于1.9～2.0。按照转录试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA。RT-PCR反应体系为20μl，包括模板2μl，上下游引物各1μl,SYBRGreenPremix10μl，双蒸水7μl。RT-PCR反应条件：95℃预变性5min;95℃变性15s,62℃退火60s,72℃延伸12s，共35个循环。引物序列见表1。采用相对定量2-ΔΔCt法表示结果，每个标本设3个复孔，结果取平均值。

表1引物序列

1.3统计学处理

采用SPSS22.0软件进行统计分析。计量资料以±s表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用独立样本t检验。lncRNA-GAS5与miR-96-5p表达的相关性采用Pearson相关分析。采用受试者工作特征（receiveroperatingcharacteristic,ROC）曲线下面积（areaunderthecurve,AUC）评价lncRNA-LINC01503、miR-335-5p单独及二者联合应用对NSCLC的诊断效能。应用在线生物信息学软件LncBasePredictedv.2预测lncRNA-GAS5与miR-96-5p的相互作用位点[8]。P<0.05为差异有显著性。

2、结果

2.1各组血清lncRNA-GAS5、miR-96-5p表达比较

与正常对照组及良性肺病组相比，NSCLC组患者血清lncRNA-GAS5的相对表达量明显较低（t=24.823、31.719,P=0.000、0.000），而血清miR-96-5p的相对表达量明显较高（t=73.964、74.792,P=0.000、0.000）。见表2。

表2各组血清lncRNA-GAS5、miR-96-5p表达比较

2.2NSCLC组患者血清lncRNA-GAS5与miR-96-5p表达的相关性及相互作用位点预测

Pearson相关分析显示，NSCLC患者血清lncRNA-GAS5与miR-96-5p的相对表达量呈明显负相关（r=-0.643,P=0.000）。见图1。LncBasePredictedv.2软件预测lncRNA-GAS5序列的338～360碱基处有与miR-96-5p互补结合的核苷酸位点。见图2。

图1NSCLC患者血清lncRNA-GAS5与miR-96-5p相对表达量的相关性

图2LncBasePredictedv.2软件预测lncRNA-GAS5序列的338～360碱基处有与miR-96-5p互补结合的核苷酸位点

2.3血清lncRNA-GAS5、miR-96-5p表达与NSCLC患者临床病理特征的关系

不同TNM分期、淋巴结转移的NSCLC患者血清lncRNA-GAS5、miR-96-5p表达差异有显著性（P<0.05），不同性别、年龄、吸烟史、病理类型、肿瘤大小、病理分级患者血清lncRNA-GAS5、miR-96-5p表达差异无显著性（P>0.05）。见表3。

表3血清lncRNA-GAS5、miR-96-5p表达与临床病理特征的关系

2.4血清lncRNA-GAS5、miR-96-5p单独及联合应用对NSCLC的诊断效能

根据各标志物的检测结果绘制诊断NSCLC的ROC曲线，结果表明，血清lncRNA-GAS5、miR-96-5p单独及联合应用诊断NSCLC的AUC分别为0.637、0.748及0.866。与lncRNA-GAS5、miR-96-5p单独应用相比，二者联合应用诊断NSCLC的敏感性、准确性、阴性预测值及AUC明显较高，而特异性、阳性预测值明显较低（P均<0.05）。见图3，表4。

图3血清标志物的ROC曲线分析

3、讨论

肺癌起源于支气管黏膜上皮或肺泡上皮，组织学分类中以NSCLC最为常见。NSCLC早期没有典型症状，出现临床症状时已处于中晚期[9]。虽然近年来新的NSCLC治疗方案及药物的出现改善了患者的预后，但临床上仍缺乏用于NSCLC早期诊断和病情监测的有效血清肿瘤标志物[10]。与组织活检相比，血清肿瘤标志物检测具有创伤小、费用低及能实时动态监测等优点，是理想的检测手段。以往认为转录过程中产生的非编码RNA是“分子垃圾”，近年来大量研究表明，非编码RNA参与调控基因表达，不仅影响正常细胞生长、分化等生理过程，还与肿瘤、免疫性疾病等有关[11,12]。

lncRNA是长度大于200个核苷酸的RNA分子，广泛表达于人体多种组织，且具有较好的组织特异性。lncRNA的异常表达参与多种疾病如阿尔茨海默病、心血管疾病及肿瘤等的发生发展，可能是疾病诊断治疗的重要靶点[13]。有研究表明，lncRNA-GAS5在卵巢癌、乳腺癌等肿瘤中表达下调，并导致凋亡相关基因的表达失调，引起肿瘤细胞的凋亡抑制及过度增殖，进而促进肿瘤进展[5,14]。本研究发现，NSCLC患者血清中lncRNA-GAS5表达较健康对照组及良性肺病组明显较低，但其机制目前尚不清楚，可能与受到m6A甲基化修饰有关[15]。NI等[15]的研究表明，lncRNA-GAS5受到m6A编码器YTHDF3的负向调控，肿瘤发生时YAP信号通路的激活能够促进m6A介导的lncRNA-GAS5降解，导致肿瘤进展。此外，本研究发现血清lncRNA-GAS5表达与肿瘤分期及淋巴结转移有关，高肿瘤分期及伴淋巴结转移的患者血清lncRNA-GAS5水平较低，考虑是因为lncRNA-GAS5可作为分子支架结合miR-196a-5p，抑制下游癌基因HOXA5的表达，进而促进肿瘤细胞的增殖及淋巴结转移[16]。此外，lncRNA-GAS5能够通过促进p21的功能，抑制蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素轴，促进癌细胞的凋亡过程[17]。以上机制提示肿瘤中lncRNA-GAS5的表达下调能够促进癌细胞的恶性生物学行为。

表4血清各标志物单独及联合应用对NSCLC的诊断效能

miRNA长度为19～23个核苷酸，参与构成RNA诱导的沉默复合体后，与目的基因mRNA的3’非翻译区靶向结合，在转录后水平调控基因的表达，与感染、炎症及肿瘤等多种疾病密切相关。相关研究显示，miR-96-5p在卵巢癌、肝癌等肿瘤中表达明显增加，可抑制AKT的磷酸化，进而抑制下游癌抑癌基因CAV1的表达，促进肿瘤细胞的增殖及迁移[7,18]。本研究中，NSCLC患者血清中miR-96-5p表达升高，且与肿瘤分期及淋巴结转移有关，其原因可能与环状RNA的表达调控有关。WEI等[19]研究发现，NSCLC肿瘤细胞中circRNAPTPRA能够结合并抑制miR-96-5p的表达，肿瘤细胞中circRNAPTPRA的表达下调导致miR-96-5p表达异常升高，促进肿瘤细胞发生上皮间质转化，因而更容易出现局部浸润及远处转移。此外，miR-96-5p还能够靶向抑制内质网应激关键分子DDIT3的表达，抑制肿瘤细胞凋亡的发生，进而促进肿瘤细胞过度增殖[20]。本研究发现，NSCLC患者血清中lncRNA-GAS5与miR-96-5p的表达呈显著负相关，推测二者可能存在相互作用的关系。应用在线生物信息学软件分析，发现二者存在相互作用的结合位点，提示NSCLC中可能存在lncRNA-GAS5对miR-96-5p的靶向调控作用，而lncRNA-GAS5低表达导致其对miR-96-5p的靶向抑制作用减弱，引起miR-96-5p的表达上调，进而促进肿瘤的恶性进展，导致肿瘤分期升高。WANG等[21]在肾小管上皮细胞中发现miR-96-5p受到lncRNA-GAS5的靶向调控作用，可促进糖尿病肾病中肾小管上皮细胞的纤维化。但NSCLC中lncRNA-GAS5与miR-96-5p相互作用的机制尚不清楚，值得深入研究。此外，本研究结果显示，联合应用lncRNA-GAS5、miR-96-5p对NSCLC的诊断效能明显高于单一指标，具有较高的敏感性和准确性，且表明二者联合检测具有较高的诊断价值，可能有助于提高NSCLC患者早期诊断的准确性。但本研究中二者联合应用诊断NSCLC的特异性不高，因此临床应用过程中可结合其他辅助检查指标，以减少误诊的发生。

综上所述，NSCLC患者血清lncRNA-GAS5的表达降低，miR-96-5p表达升高，两者呈负相关，血清lncRNA-GAS5及miR-96-5p的表达与肿瘤分期及淋巴结转移有关，可能是影响NSCLC发生发展的重要分子。联合检测血清lncRNA-GAS5、miR-96-5p对于NSCLC具有较高的诊断效能，有可能成为诊断NSCLC新的血清标志物。

参考文献：

[6]汤建华,樊頔,牛玉春,等.lncRNA-GAS5调节Notch通路对肺癌A549细胞血管生成拟态的影响[J].临床与实验病理学杂志,2019,35(12):30-35.

[9]马成龙,沈冬,孙晓,等.LAG-3在非小细胞肺癌细胞中的异位表达及其临床意义[J].中国医刊,2019,54(9):1005-1008.

[10]朱莉莉,袁新平.CT联合血清肿瘤标志物水平检测在周围型肺癌患者中的诊断价值[J].中国医师杂志,2019,21(10):1529-1532.

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王庆华,蔡宏剑,马明超,程龙,袁荣正.非小细胞肺癌患者血清长链非编码RNA-GAS5､微小RNA-96-5p的表达及临床意义[J].中国医刊,2021,56(04):386-390.