肺癌是起源于肺部支气管黏膜或腺体的恶性肿瘤，其发病率和病死率增长快，严重威胁人类的生命健康[1]。肺癌具有生长快，转移早，易复发的特点[2]。根据肿瘤细胞的形态可分为非小细胞肺癌（non-small cell lung carcinoma,NSCLC）和小细胞肺癌（small cell lung carcinoma,SCLC）。肺癌临床治疗方式以化疗、放疗、手术为主，手术费用昂贵；放化疗毒副作用大，易耐药[3,4]。金属元素铷（Rubidium,Rb）为第四周期第一主族元素，其化学性质极为活泼，为碱族金属之一[5]。本课题组经过前期研究，以中国越城岭岩体白岗岩矿脉的含铷钠长正长岩为原料，对铷矿物质开展了相关的试验研究。铷矿物质具有无放射性且相对易于纯化的特点，经纯化后可安全用于科研与医疗研究。本研究采用Lewis肺癌（Lewis lung cancer,LLC）细胞对小鼠右腋下构建小鼠移植瘤模型，采用鼠源肺部高转移性B16-F10恶性黑色素瘤细胞进行尾静脉注射C57BL/6J小鼠构建肺癌转移模型[6]，观察动物的体质量、肿瘤增长、血常规、细胞因子、组织病理切片等方面，研究铷矿物质对肺癌移植瘤与肺癌转移的影响，为铷矿物质在治疗肺癌及其转移中提供前期研究基础和理论依据。

1、材料

1.1 细胞

小鼠Lewis肺癌细胞株（LLC/LUC细胞）购自ATCC，鼠源高转移性B16-F10细胞株购自中国科学院。

1.2 动物

C57BL/6小鼠，雄性，体质量18～22 g，购自维通利华生物有限公司，实验动物生产许可证：SCXK（京）2021-0006。小鼠饲养于广西中医药大学科学实验中心，小鼠自由饮水进食，实验动物使用许可证：SYXK桂2019-0001。本研究已通过广西中医药大学伦理委员会审核（DW2 0220511-193）。

1.3 药材

铷矿物质，由广西中铷健康产业公司提供。

1.4 主要试剂与仪器

高糖DMEM培养基；胎牛血清（FBS);0.25%胰蛋白酶；青链霉素混合液（100×）。细胞培养瓶；纯水系统（Milli-Q）；电子天平（METTLER TOLEDO）；移液枪（Eppendorf）；全自动血细胞分析仪（mindray,BC-5000Vet）；荧光正置显微镜（OLYMPUS BX53）。

2、方法

2.1 细胞培养

复苏小鼠Lewis肺癌细胞株（LLC细胞）和鼠源高转移性B16-F10细胞后，分别接种于细胞培养瓶中，加入含10%胎牛血清和1%双抗DMEM完全培养基，置于37℃，5%CO2培养箱培养。细胞2～3 d传代1次。细胞长满至80%时，加入0.25%胰酶消化，进行传代或者制成细胞悬液。

2.2 模型与分组给药

通过腋下注射鼠源肺癌LLC细胞（5×105个细胞/只）构建移植瘤肺癌小鼠模型。取对数期生长的LLC细胞，制成5×105个细胞的细胞悬液。碘伏消毒C57BL/6小鼠右腋窝后，每只小鼠皮下注射细胞悬液0.2 mL，观察成瘤情况。待触摸到成瘤后，用游标尺测量瘤的长径（L）和短径（W），肿瘤体积V=L×W2/2。通过尾静脉注射鼠源高转移性B16-F10细胞（5×105个细胞/只）构建小鼠肺癌转移模型。取对数期生长B16-F10细胞，制成5×105个细胞的细胞悬液。碘伏消毒C57BL/6小鼠尾静脉后，每只小鼠尾静脉注射细胞悬液0.2 mL,4 d后视为模型小鼠。将移植瘤C57BL/6J小鼠按肿瘤体积、肺癌转移小鼠按体质量分别使用Excel软件区组分层随机分组法分为6组：铷矿物质设低、中、高（25,50,100 mg·kg-1)3个剂量组，另设吉非替尼组（40 mg·kg-1）、模型对照组和空白对照组，每组7只小鼠；按小鼠体质量0.1 mL·10 g-1进行药物干预，铷矿物质各剂量组、空白组、模型组灌胃，吉非替尼组采用腹腔注射，1天1次，移植瘤试验中连续给药14 d，肺癌转移实验组小鼠持续给药18 d，并记录体质量。

2.3 检测指标

末次给药24 h，麻醉后摘眼球取血,采用血常规检测仪检测血液中白细胞（WBC）、中性粒细胞（Neu）、淋巴细胞（Lym）水平。采血结束后，将小鼠进行安乐死，迅速分离肿瘤、心、肝、脾、肺、肾，记录重量后，采用4%多聚甲醛固定，进行包埋，切片，伊红-苏木素（HE）染色，光镜下观察组织病理学改变。ELISA试剂盒检测移植瘤小鼠肿瘤与血清中白细胞介素（IL)-6、IL-1β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α）以及ROS表达情况。

2.4 统计学方法

采用GraphPad Prism 8.4.3软件进行统计学分析，数据均以标准差±平均值（）表示，单因素方差分析（ANOVA）评价组间差异的显著性，以P<0.05表示差异有统计学意义。

3、结果与分析

3.1 铷矿物质对肺癌移植瘤小鼠的影响

3.1.1 铷矿物质对肺癌移植瘤小鼠体质量的影响

与空白对照组比较，模型对照组体质量均明显降低（P<0.05）；与模型对照组比较，铷矿物质各剂量组与吉非替尼组小鼠药后体质量均显著高于模型对照组（P<0.01）。结果显示，模型对照组小鼠出现体质量减轻和增长缓慢现象，而铷矿物质和吉非替尼可改善LLC肺癌移植瘤小鼠的体质量减轻、增长缓慢。

3.1.2 铷矿物质对肺癌移植瘤小鼠血常规WBC、Neu、Lym的影响

与空白对照组比较，模型对照组血常规WBC、Neu、Lym含量均显著升高（P<0.001）；与模型对照组比较，铷矿物质各剂量组小鼠给药后血常规WBC、Lym含量显著低于模型对照组（P<0.01），铷矿物质100 mg·kg-1剂量组小鼠给药后血常规的Neu含量显著低于模型对照组（P<0.01），铷矿物质25 mg·kg-1与铷矿物质50 mg·kg-1剂量组小鼠给药后血常规Neu有降低趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）；吉非替尼组小鼠药后血常规WBC、Neu、Lym含量均显著低于模型对照组（P<0.01）。结果显示，模型对照组小鼠血常规WBC、Neu、Lym升高，铷矿物质和吉非替尼可拮抗腋下注射LCC细胞所致的血常规WBC、Neu、Lym升高。

3.1.3 铷矿物质对肺癌移植瘤的作用

与空白对照组比较，模型对照组小鼠腋下有明显的实体瘤；与模型对照组比较，吉非替尼组和铷矿物质各剂量组小鼠腋下实体瘤体积和重量明显偏小。结果显示，腋下注射鼠源肺癌LLC细胞可导致小鼠腋下形成肿瘤，吉非替尼和铷矿物质各剂量有抑制瘤细胞肺增长作用（P<0.01），见图1。

图1 铷矿物质对小鼠肺癌抑制瘤的作用   

3.1.4 铷矿物质对肿瘤组织病理学的影响

肿瘤组织HE染色结果可见，肺癌小鼠模型组肿瘤细胞分布多，细胞核变大，出现多核、异核的情况；吉非替尼组和铷矿物质各剂量组，肿瘤细胞数目减少，细胞核缩小，且肿瘤组织出现不同程度坏死。说明铷矿物质各剂量组和吉非替尼组能够明显抑制肿瘤增长。见图2。

图2 铷矿物质对肿瘤组织病理学的影响（HE，×20)   

3.1.5 铷矿物质对肺癌移植瘤小鼠各脏器组织病理学的影响

脏器组织HE染色结果可见，与正常小鼠比较，模型对照组小鼠的心、肝、肺、肾无明显损伤，脾脏正常生理结构消失，组织分布弥漫。与模型对照组比较，吉非替尼组和铷矿物质各剂量组小鼠心、肝、肺、肾无明显损伤，脾脏的损伤较模型组轻。说明铷矿物质各剂量组和吉非替尼组对心、肝、肺、肾无影响。

3.1.6 铷矿物质对肺癌移植瘤小鼠脾脏的影响

对脾脏的质量进行比较，发现与空白对照组比较，模型对照组小鼠脾质量明显升高（P<0.01）；与模型对照组比较，吉非替尼组和铷矿物质25 mg·kg-1与铷矿物质50 mg·kg-1剂量组脾质量降低（P<0.01或P<0.05），铷矿物质100 mg·kg-1剂量组脾质量有所降低，但差异无统计学意义（P>0.05）。通过HE染色，光镜下检查脾脏的病理状态，发现模型对照组小鼠脾脏正常生理结构发生变化，出现炎症细胞浸润；铷矿物质各剂量组小鼠脾脏出现中度炎症细胞浸润情况，生理结构正常。结果显示，腋下注射鼠源肺癌LLC细胞可引起脾脏发生病变，而吉非替尼和铷矿物质各剂量可能会通过脾脏的免疫功能抑制瘤细胞肺增长。

3.1.7 铷矿物质对肺癌移植瘤小鼠炎症因子和活性氧（ROS）的影响

通过ELISA试剂盒检小鼠血清，结果显示，与空白对照组比较，模型对照组血清IL-1β、IL-6、ROS含量升高，TNF-α含量降低（P<0.05或P<0.01）；吉非替尼和铷矿物质各剂量组可降低IL-6与ROS含量，升高TNF-α含量（P<0.05或P<0.01）。与模型对照组比较，吉非替尼组和铷矿物质各给药剂量组肿瘤组织中IL-1β、IL-6含量降低，TNF-α含量升高（P<0.05或P<0.01）。结果显示，吉非替尼和铷矿物质各剂量组可能通过调节炎症反应与氧化应激抑制肿瘤细胞增殖。

3.2 铷矿物质对肺瘤转移小鼠的影响

3.2.1 铷矿物质对肺癌转移小鼠体质量的影响

与空白对照组比较，模型对照组体质量均显著降低；与模型对照组比较，吉非替尼组小鼠药后体质量均显著高于模型对照组；铷矿物质各剂量组小鼠给药后体质量均显著高于模型对照组。结果显示，模型对照组小鼠体质量减轻和体质量增长减慢，吉非替尼和铷矿物质可改善B16-F10肺癌转移小鼠的体质量减轻、体质量增长减慢。

3.2.2 铷矿物质对肺癌转移小鼠血常规的影响

与空白对照组比较，模型对照组小鼠血液中WBC和Neu水平均显著升高（P<0.01）；与模型对照组比较，吉非替尼组和铷矿物质各剂量组小鼠血液Neu和WBC水平均显著降低（P<0.01）。结果显示，尾静脉注射B16-F10细胞可导致C57BL/6J小鼠血液WBC和Neu水平升高，吉非替尼和铷矿物质能够降低WBC和Neu水平。

3.2.3 铷矿物质对肺癌转移小鼠肺湿重的影响

与空白对照组比较，模型对照组小鼠肺湿重显著升高；与模型对照组比较，吉非替尼组和铷矿物质各剂量组小鼠的肺湿重显著降低（P<0.01）。结果显示，与空白对照组比较，尾静脉注射B16-F10细胞构建的肺转移癌小鼠模型的肺湿重增加，吉非替尼组和铷矿物质各剂量组具有降低肺湿重的作用，见图3。

3.2.4 铷矿物质对肺癌转移组织病理学的影响

肺组织HE染色结果可见，小鼠恶性黑色素瘤肺转移模型组与空白对照组比较，肺组织具有大量肺转移灶，且周围有炎症细胞浸润、肺充血现象，吉非替尼组和铷矿物质各剂量组能够明显抑制炎症反应和恶性黑色瘤的肺转移，见图4。

图3 铷矿物质对小鼠肺湿重的影响   

图4 铷矿物质对小鼠肺癌转移组织病理学的影响   

4、讨论

铷是人体必需的重要微量元素，在体内无法合成，必须由外界摄入[7]。在动物试验中发现，铷可降低肿瘤平均重量；肺癌、胃癌结肠癌病灶组织中的铷含量也高于非病灶组织含量，铷激光局部热疗法逐渐成为肝癌的各种介入型综合疗法[8]。本研究通过研究铷矿物质对移植瘤肺癌小鼠的影响发现，在使用铷矿物质干预治疗肺癌小鼠14 d后，肿瘤体积增长缓慢，铷矿物质各剂量组的肿瘤重量与体积都较模型对照组小；光镜下，肿瘤病理切片提示，铷矿物质各剂量组肿瘤细胞数目减少，肿瘤组织正在发生坏死，正常细胞形态数量增加，提示铷矿物质对肿瘤的增长有抑制作用。通过研究铷矿物质对转移肺癌小鼠的影响发现，在使用铷矿物质干预治疗肺癌小鼠18 d后，铷矿物质各剂量组的小鼠肺组织湿重降低；光镜下，肺部HE染色病理切片提示，小鼠恶性黑色素瘤肺转移模型组与空白对照组比较，肺组织含有大量肺肿瘤转移灶，且周围有炎症细胞浸润、肺充血现象，而铷矿物质各剂量组和吉非替尼组能够明显抑制炎症反应和恶性黑色瘤的肺转移。需进一步研究铷矿物质对肺癌抑制作用具体的机理。

淋巴细胞是人体特异性免疫的重要分子，其数量的增加提示特异性免疫被激发，WBC和Neu的增加提示非特异性免疫功能得到充分发挥[9]。肿瘤细胞的产生可引起大量炎症介质释放，导致WBC升高。中性粒细胞的增殖会抑制淋巴细胞，肿瘤患者处于疾病晚期时，免疫功能差，其淋巴细胞减少。免疫系统包括免疫监视和抗肿瘤免疫反应等，对肿瘤的形成和发展起重要作用，肿瘤患者的免疫功能差，使得肿瘤细胞得以生存[10]。本研究中，肺癌移植瘤模型对照组与肺癌转移模型对照组小鼠体重均减轻，增长减缓，吉非替尼和铷矿物质均可减缓该影响的发生。肺癌移植瘤模型对照组与肺癌转移模型对照组小鼠血常规WBC、Neu、Lym升高，提示肿瘤的产生启动了免疫应答，吉非替尼和铷矿物质可拮抗肿瘤细胞所致的血常规WBC、Neu、Lym升高，提示铷矿物质可能是通过免疫反应进行调控肿瘤的增殖与转移。

非小细胞肺癌为肺癌的主要病理类型，因绝大多数患者确诊时处于疾病晚期，治疗效果不佳，免疫治疗在提高肺癌患者的预后发挥了重要作用。炎症因子IL-6、TNF-α和IL-1β在介导机体感染免疫、肿瘤免疫、自身免疫等方面发挥重要的作用。癌症患者免疫功能受到抑制，由于细胞免疫功能失调，致使TNF-α水平失衡。在机体炎症免疫反应早期可产生TNF-α，诱导各种细胞因子产生，进而防御机体[11];TNF-α水平升高是免疫系统激活的标志之一[12]。据报道，IL-6介导的炎症可提高NSCLC的发病率和病死率，机体受到损伤或刺激时，IL-6水平上升[13]。IL-1β为细胞炎症因子的一种，可介导机体炎症反应的产生，作为重要的免疫调节因子同时在抗肿瘤生理过程中发挥重要作用。本研究通过ELISA试剂盒检测移植瘤小鼠血清与肿瘤中的IL-1β、IL-6、TNF-α，发现与空白对照组相比，模型对照组血清IL-1β、IL-6、ROS含量升高，TNF-α含量降低；而吉非替尼和铷矿物质各剂量组可降低IL-6含量，升高TNF-α含量。与模型对照组比较，吉非替尼组和铷矿物质各给药剂量组肿瘤组织中IL-1β、IL-6含量降低，TNF-α含量升高。结果提示，腋下注射鼠源肺癌LLC/LUC细胞可引起小鼠产生炎症反应，而吉非替尼和铷矿物质各剂量组可能会通过介导炎症反应抑制肿瘤细胞的增殖。

脾是体内最大的免疫功能的组织，在维持免疫稳态发挥重要作用，其淋巴细胞数量变化与机体免疫功能密切相关[14]，当脾的免疫功能出现紊乱时，细胞因子IL-6,TNF-α,IL-1β的分泌水平发生改变，脾指数的变化能反应机体免疫功能的恢复状况[15]。本研究通过对肿瘤组织与脾脏进行HE染色，光镜下检查脾脏的病理状态，发现脾脏的形态发生了变化。与空白对照组比较，模型对照组小鼠脾质量明显升高；与模型对照组比较，吉非替尼组和铷矿物质各剂量组脾重降低。结果显示，腋下注射鼠源肺癌LLC细胞可引起脾脏发生病变，而吉非替尼和铷矿物质各剂量可能会通过脾脏的免疫功能抑制瘤细胞肺增长。在心、肝、肺、肾等组织中未发现肿瘤细胞以及病理损伤。同时在铷矿物质对肺癌转移的研究中发现，铷矿物质可减少B16-F10细胞转移到肺部。提示铷矿物质可能是通过免疫反应进行抑制肿瘤的增殖。

随着恶性肿瘤氧化应激的深入研究，发现ROS的积累可诱导肺癌细胞凋亡，清除过量的ROS能够阻止癌细胞死亡，ROS作为氧化应激的重要指标，以ROS作为突破点，调节NSCLC细胞氧化应激，从而达到抑制肿瘤细胞的目的[16]。本项目通过ELISA试剂盒检测小鼠血清与肿瘤中的ROS，研究铷矿物质与氧化应激可能存在的影响。发现与空白对照组相比，模型对照组血清、ROS含量升高；吉非替尼和铷矿物质各剂量组可降低ROS含量。提示吉非替尼和铷矿物质各剂量组可能会通过介导氧化应激反应抑制肿瘤细胞的增殖。

综上所述，铷矿物质能够显著抑制LLC小鼠移植瘤和B16-F10小鼠肺癌转移的形成，其作用机制可能通过调节机体免疫，降低炎症因子水平、抑制ROS生成，从而发挥治疗肺癌作用。

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基金资助:国家青年岐黄学者人才项目(2020-7);广西高等学校高水平创新团队项目(2019-52);广西中医药大学2022年研究生教育创新计划项目;

文章来源:盘家萍,黄映捷,张东洁,等.铷矿物质抑制小鼠肺癌增殖与转移作用及机制研究[J].长春中医药大学学报,2024,40(04):398-403.