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川楝素通过调控CDCA5表达对肺腺癌细胞体内外生长的抑制作用
摘要：目的 研究川楝素通过调控细胞分裂与周期相关蛋白5(CDCA5)的表达对肺腺癌细胞体内外生长的抑制作用。方法 用TCGA数据库分析CDCA5在不同肺组织中的表达情况；用蛋白质印迹法检测BEAS-2B细胞和A549细胞中CDCA5表达水平；用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法检测不同浓度川楝素对A549细胞的存活率的影响。将A549细胞随机分为4组，对照组为正常细胞正常培养；川楝素组为正常细胞加入40μmol·L-1川楝素培养；川楝素+pcDNA组和川楝素+CDCA5组分别在转染pcDNA空载体和CDCA5过表达载体后，加入40μmol·L-1川楝素培养。培养48 h后，用CCK-8和流式细胞术检测各组细胞增殖和凋亡情况，以蛋白质印迹法检测各组细胞增殖和凋亡相关蛋白的表达水平。将BALB/c裸鼠随机分组并构建sh-NC和sh-CDCA5稳转细胞株与裸鼠移植瘤模型，每日分别腹腔注射0.9%NaCl和40μmol·L-1的川楝素溶液，观察并记录肿瘤组织体积、体质量变化。结果 CCK-8结果显示：A549细胞经10、20、30、40、50、60、70μmol·L-1川楝素干预48 h后的存活率分别为(80.74±8.71)%、(72.96±6.53)%、(61.01±4.86)%、(51.20±3.13)%、(42.10±5.94)%、(38.93±3.18)%和(33.48±2.94)%,川楝素对A549细胞增殖具有显著的抑制作用。对照组、川楝素组、川楝素+pcDNA组和川楝素+CDCA5组的细胞增殖率分别为(100.00±4.19)%、(49.18±6.70)%、(55.75±5.74)%和(77.66±7.48)%,CDCA5蛋白相对表达水平分别为1.08±0.11、0.44±0.04、0.43±0.05、0.99±0.10。sh-NC组、sh-CDCA5组、川楝素+sh-NC组和川楝素+sh-CDCA5组裸鼠肿瘤组织中CDCA5蛋白相对表达水平分别为1.04±0.14、0.42±0.04、0.56±0.08、0.32±0.04。与sh-NC组相比，其他各组裸鼠形成的肿瘤块均明显减小、肿瘤体积和质量均明显下降(均P<0.05)。与川楝素+sh-NC组相比，川楝素+sh-CDCA5组对肿瘤形成的抑制作用更明显，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论 川楝素对肺腺癌细胞在体内外的生长均具有抑制作用，主要与抑制CDCA5的表达有关。
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肺癌是一种恶性肿瘤，主要由小细胞肺癌和非小细胞肺癌组成，其中肺腺癌可占非小细胞肺癌总数的50%以上[1,2]。川楝素(toosendanin, TSN)是从传统中药苦楝子和川楝皮中提取出的一种萜类化合物，现代药理研究表明，川楝素具有驱虫、抗炎镇痛、抗肉毒素等作用，且能够抑制肿瘤细胞增殖和促进细胞凋亡，从而具有良好的抗肿瘤活性[3,4]。本文主要对川楝素对肺腺癌细胞体内外生长的抑制作用进行研究，并进一步探讨其潜在作用机制。
一、材料与方法
1 材料
动物6周龄的BALB/c裸鼠，体质量18～20 g, 购自南方医科大学。动物生产许可证号：SCXK(粤)2021-0041。本实验经濮阳医学高等专科学校动物实验伦理委员会批准(伦理批号：2023-0824)。
细胞株BEAS-2B人正常肺上皮细胞和A549人非小细胞肺癌细胞，均购自深圳市豪地华拓生物科技有限公司。
药品与试剂川楝素，纯度：≥98%,批号：111842-201804,成都普思生物科技有限公司生产。洛斯维·帕克纪念研究所(Roswell Park Memorial Institute-1640,RPMI-1640)完全培养基，上海雅吉生物科技有限公司生产；细胞计数试剂盒-8(cell coun-ting kit-8,CCK-8)试剂盒，武汉菲恩生物科技有限公司生产；Lipofectamine 3000转染试剂，北京索莱宝科技有限公司生产；Opti-MEM减血清培养基，北京博蕾德生物科技有限公司生产；pcDNA6/V5-His C,上海钰博生物科技有限公司生产；细胞凋亡试剂盒，杭州倍沃医学科技有限公司生产；细胞分裂周期相关蛋白5 (cell division cycle associated protein 5, CDCA5)、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-associated X,Bax)、剪切的胱天蛋白酶3(cleaved cysteine aspartic acid specific protease-3,Cl-caspase-3)抗体，均为美国CST公司生产；Ki67抗体，英国Abcam公司生产；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)蛋白浓度测定试剂盒，南京诺唯赞生物科技股份有限公司生产。CDCA5过表达载体的构建，由上海生工生物工程股份有限公司完成。
仪器BB150-2TCS CO2细胞培养箱，Multiskan FC酶标仪，均为美国赛默飞世尔科技公司产品；FACSVia流式细胞仪，美国BD公司产品；ZF-288全自动凝胶成像分析系统，上海嘉鹏仪器有限公司产品。
2 实验方法
2.1 细胞实验
2.1.1 细胞处理及蛋白质印迹法检测CDCA5的表达水平
取处于对数生长期的BEAS-2B细胞和A549细胞，从细胞提取总蛋白，用BCA蛋白检测试剂盒进行定量。用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，每孔上样量均为20 μg, 并转移到聚偏二氟乙烯膜上。在室温下用5%脱脂牛奶封闭1 h后，将膜浸泡在一抗溶液(1∶1 000)中4 ℃过夜孵育，然后在室温下用二抗(1∶2 000)孵育1 h。用全自动凝胶成像分析系统对信号进行可视化。以β-actin作为内参，对CDCA5蛋白的表达进行定量计算。
2.1.2 CCK-8法检测各组细胞存活率[5]5]
取对数生长期的A549细胞，加入96孔板中，过夜培养。加入终浓度为0、10、20、30、40、50、60、70 μmol·L-1的川楝素与A549细胞共培养，并分别在培养24、48、72 h时，向每孔中加入CCK-8试剂10 μL,用酶标仪测定在450 nm处的光密度值，计算细胞存活率。每组实验重复5次。
2.1.3 细胞转染与处置方法[6,7]6-7]
将A549细胞随机分为对照组、川楝素组、川楝素+pcDNA组和川楝素+CDCA5组，每组5个复孔。用Opti-MEM培养基分别稀释Lipofectamine 3000转染试剂、CDCA5过表达载体和pcDNA空载体，将稀释过的载体与转染试剂按比例混匀后培养细胞，培养6 h后，更换培养基终止转染。
对照组为正常细胞加入培养基培养；川楝素组为正常细胞加入含有40 μmol·L-1川楝素的培养基进行培养；川楝素+pcDNA组是在细胞转染入pcDNA空载体后，加入含有40 μmol·L-1川楝素的培养基培养；川楝素+CDCA5组为转染入CDCA5过表达载体的细胞，用含有40 μmol·L-1川楝素的培养基继续培养，均培养48 h。
2.1.4 CCK-8和流式细胞术检测川楝素对细胞存活率和凋亡率的影响[8,9]8-9]
取各组细胞，每孔加入CCK-8试剂10 μL,用酶标仪测定光密度，并计算细胞存活率。
取各组细胞，加入0.25%胰蛋白酶分离消化细胞，制备细胞悬液，向细胞悬液中加入Annexin V-异硫氰酸荧光素和PI混匀，室温避光染色15 min, 用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
2.1.5 蛋白质印迹法检测各组细胞CDCA5蛋白、增殖和凋亡相关蛋白的表达水平[10]10]
取各组细胞，裂解细胞后提取总蛋白，对提取的总蛋白用试剂盒进行定量检测。按照“2.1.1”中的方法检测CDCA5蛋白、增殖和凋亡相关蛋白的表达水平。
2.2 动物实验——检测肿瘤体积、质量变化和CDCA5蛋白表达情况[11,12]11-12]
将BALB/c裸鼠随机分为4组，分别为sh-NC组、sh-CDCA5组、川楝素+sh-NC组和川楝素+sh-CDCA5组，每组8只裸鼠。参照“2.1.3”方法构建sh-NC和sh-CDCA5稳转细胞株，分别将转染了空载体(sh-NC)和CDCA5沉默表达载体(sh-CDCA5)的细胞使用PBS处理制备细胞悬液，使细胞密度为3×107 cell·mL-1,分别将细胞悬液0.2 mL接种于裸鼠背部皮下位置，建立裸鼠皮下移植瘤模型。sh-NC组、sh-CDCA5组每日腹腔注射0.9%NaCl, 川楝素+sh-NC组和川楝素+sh-CDCA5组每日腹腔注射40 μmol·L-1的川楝素溶液，每日1次，持续15 d。成瘤后，每6 d测量一次肿瘤体积，4周后将裸鼠麻醉处死，剥离肿瘤组织并称重。用蛋白质印迹法对肿瘤组织的CDCA5蛋白表达水平进行检测。
2.3 癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas, TCGA)数据库分析[13]13]
从TCGA数据库中查询并下载了347例正常肺组织样本和483例肺腺癌样本的CDCA5 mRNA数据，对其进行均一化处理，分析比较表达水平差异。
3 统计学处理
用SPSS 26.0软件进行统计分析。用表示，2组间差异用t检验比较，用单因素方差对多组间差异进行分析。
二、结果
1 川楝素对A549细胞存活率的影响
川楝素对A549细胞增殖具有显著的抑制作用，且呈剂量依赖，见表1。40 μmol·L-1川楝素作用于A549细胞48 h时，细胞存活率在50%左右，因此后续体外细胞实验均选用40 μmol·L-1川楝素作用于A549细胞48 h。
表1 川楝素对各组细胞存活率的影响
2 CDCA5在肺腺癌中的表达
TCGA数据库显示，CDCA5在肺腺癌组织(3.27±1.46)中的表达水平更高，与正常肺组织(1.36±0.72)比较，在统计学上差异有统计学意义(P<0.05)。蛋白质印迹实验结果显示，BEAS-2B和A549细胞中CDCA5蛋白相对表达水平分别为0.34±0.03和1.06±0.10(P<0.05)。
3 川楝素可通过CDCA5抑制A549细胞增殖和凋亡
对照组为正常细胞加入培养基培养；川楝素组为正常细胞加入含有40 μmol·L-1川楝素的培养基进行培养；川楝素+pcDNA组是在细胞转染入pcDNA空载体后，加入含有40 μmol·L-1川楝素的培养基培养；川楝素+CDCA5组为转染入CDCA5过表达载体的细胞，用含有40 μmol·L-1川楝素的培养基继续培养。
CCK-8结果显示，川楝素作用A549细胞后可明显降低细胞的增殖率(P<0.05),并明显升高细胞的凋亡率(P<0.05)。与川楝素+pcDNA组相比，川楝素+CDCA5组细胞在CDCA5过表达的情况下，细胞增殖率明显升高(P<0.05),细胞凋亡率明显下降(P<0.05),见表2。
4 川楝素通过CDCA5对A549细胞增殖和凋亡相关蛋白表达的影响
与对照组相比，川楝素组CDCA5蛋白、Ki67蛋白和Bcl-2蛋白相对表达水平均明显降低(均P<0.05),Bax蛋白和Cl-caspase-3蛋白相对表达水平均明显上升(均P<0.05)。与川楝素+pcDNA组相比，川楝素+CDCA5组细胞中DCA5蛋白、Ki67蛋白和Bcl-2蛋白相对表达水平均明显升高(均P<0.05),而Bax蛋白和Cl-caspase-3蛋白相对表达水平均明显降低(均P<0.05),见表3。
5 川楝素在体内抑制肿瘤生长
sh-NC组、sh-CDCA5组每日腹腔注射0.9%NaCl, 川楝素+sh-NC组和川楝素+sh-CDCA5组每日腹腔注射40 μmol·L-1的川楝素溶液，每日1次，持续15 d。
随着时间的增加，各组肿瘤组织体积呈现增长趋势，见表4。
表2 川楝素通过CDCA5对A549细胞增殖和凋亡的影响
表3 川楝素通过CDCA5对A549细胞增殖和凋亡相关蛋白的影响
表4 川楝素对肿瘤体积变化的影响
表5 川楝素对CDCA5蛋白表达和肿瘤质量变化的影响
sh-NC组肿瘤体积和质量最大，与sh-NC组相比，其他各组裸鼠肿瘤组织中CDCA5蛋白相对表达水平明显降低，肿瘤体积和质量均明显下降(均P<0.05)。与川楝素+sh-NC组相比，Toosendanin+sh-CDCA5组CDCA5蛋白相对表达水平更低，肿瘤体积和质量更低，对肿瘤形成的抑制作用更明显，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。结果见表4和表5。
三、讨论
本实验结果证实，川楝素可以明显抑制A549细胞增殖，且具有剂量依赖性。同时，本研究结果发现，川楝素作用后会明显下调CDCA5蛋白的表达水平，说明川楝素对于非小细胞肺癌细胞增殖的抑制作用可能与CDCA5蛋白的表达有关。
本实验结果发现，当CDCA5蛋白过表达时，会明显增加A549细胞的增殖率，抑制细胞凋亡，调控增殖和凋亡相关蛋白的表达。在体外实验结果中也发现，在抑制CDCA5蛋白表达的基础上，加以川楝素治疗，对肿瘤组织的抑制作用更明显，进一步验证了实验结果的准确性。
本研究提示：川楝素可通过抑制CDCA5蛋白的表达明显抑制A549细胞的增殖，促进细胞凋亡；且通过体内实验可以看出，川楝素作用可抑制CDCA5的表达从而抑制肿瘤组织的形成。
参考文献:
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文章来源:张志成,苏丽霞,孟瑞玲,等.川楝素通过调控CDCA5表达对肺腺癌细胞体内外生长的抑制作用[J].中国临床药理学杂志,2024,40(07):994-998.
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2024-04-15
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